Sistemas de efluxo multidrogas em Escherichia coli isoladas de mastite bovina e uso de seus inibidores como possíveis adjuvantes | Multidrug efflux systems in Escherichia coli isolated from bovine mastitis and use of their inhibitors as possible adjuvants

A mastite é uma das doenças mais relevantes do rebanho leiteiro, a qual tem um grande impacto econômico na cadeia produtiva do leite. A etiologia bacteriana desta enfermidade tem mudado de patógenos contagiosos para ambientais onde Escherichia coli, é um dos principais agentes etiológicos. Entre outros fatores, falhas na terapia poderiam ser atribuídas aos sistemas de efluxo multidrogas presentes em bactérias. Estes sistemas têm a capacidade de expulsar antimicrobianos praticamente de todas as classes, contribuindo na sua resistência. Estudaram-se 27 isolados de Escherichia coli provenientes de leite de bovinos com mastite, os quais foram submetidos a testes de sensibilidade aos principais antimicrobianos usados no tratamento desta doença na região. A técnica de reação em cadeia da polimerase, foi utilizada para identificar a presença de genes que codificam três sistemas de efluxo multidrogas, AcrAB, AcrEF e EmrAB. Avaliou-se também a efetividade in vitro de dois inibidores desses sistemas, o Phe-Arg-ß-naphthylamide e 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine, utilizando a Concentração Inibitória Mínima (CIM) como referência. Nos isolados resistentes, quantificou-se a expressão relativa dos genes relacionados a esses sistemas, em relação aos sete tratamentos realizados, pela técnica de PCR em Tempo Real. Os resultados revelaram que apenas quatro isolados de E. coli (14,8%), apresentaram resistência a ampicilina e a sulfametoxazol∕trimetoprim, simultaneamente. Enquanto todos os 27 foram sensíveis a ceftiofur, gentamicina, enrofloxacina e cefalexina. Os isolados apresentaram pelo menos um sistema de efluxo multidrogas. Na CIM, observaram-se valores para ampicilina variando de 6 μg/mL a 250 μg/mL e para sulfametoxazol∕trimetoprim de 12 μg/mL a 1500 μg/mL e verificou-se redução das CIM de ampicilina e sulfametoxazol∕trimetoprim em todos os isolados na presença dos dois inibidores, exceto para sulfametoxazol∕trimetoprim na presença do NMP. Os genes analisados apresentaram diferentes níveis de expressão relativa em relação aos sete tratamentos realizados, embora a literatura reporte que o sistema de efluxo AcrAB-TolC é o principal em E. coli, os genes que constituem esse sistema foram os que menos se expressaram, porem os genes emrA e emrB tiveram as maiores expresoes relativas. Verificou-se que os inibidores avaliados contribuíram na diminuição da expressão relativa do gene acrF, no tratamento com ampicilina.

Mastitis is one of the most important diseases of the dairy herd, which has has great economic impact on the milk production chain. The bacterial etiology of this disease had moved from contagious pathogens for environmental ones in which Escherichia coli, is one of the main etiologic agents. Among other things, crashes in therapy could be attributed to the multidrug efflux systems present in bacteria. These systems have the ability to drive virtually all antimicrobial classes, thus contributing to its resistance. Were studied 27 strains of Escherichia coli from cattle with clinical mastitis, which were subjected to sensitivity tests, to the main antimicrobials used in the treatment of this disease in the region. The technique of polymerase chain reaction, was used to identify the presence of genes encoding three multidrug efflux systems, AcrAB, AcrEF and EmrAB. We also evaluated in vitro effectiveness of two inhibitors of these systems, the Phe-Arg-ß-naphthylamide (PAßN) and 1 -(1-naphthylmethyl)-piperazine (NMP), using the minimum inhibitory concentration (MIC) as a reference. In the resistant strains was quantified the relative expression of genes related aspect of these systems in relation to the seven treatments performed by the technique of Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR). The results showed that only four strains of E. coli (14.8%) were resistant to ampicillin and trimethoprim/sulfamethoxazole, simultaneously. However, all 27 strains were sensitive to ceftiofur, gentamicin, enrofloxacin and cephalexin. The isolates showed at least a multidrug efflux system. In MIC were observed for values ranging from 6 mg ampicillin / mL to 250 mg / mL, and trimethoprim / sulfamethoxazole 12 mg / mL to 1500 mg / mL and was found to reduce the MIC of ampicillin and trimethoprim/ sulfamethoxazole in all isolates in the presence of two inhibitors, except for trimethoprim / sulfamethoxazole in the presence of NMP. The genes analyzed showed different relative expression levels, relative to the seven treatments done, although literature reporting the AcrAB-efflux system is the main Tolc E. coli, the genes that constitute this system were the least expressed themselves, but the genes Emra and emrB had the highest relative expressions. It has been found that inhibitors contributed to the measured decrease in the relative expression of the gene acrF, treatment with ampicillin.