Gene expression profile in gyr and crossbreed dairy cows with mastitis | Perfil de expressão gênica em vacas gir e mestiças com mastite

Dentre os problemas sanitários na produção animal, as doenças infectocontagiosas são as que mais se destacam, sendo a mastite uma das principais doenças em gado de leite. Esta se caracteriza por uma resposta inflamatória na glândula mamária na qual ocorre um influxo de células somáticas compostas principalmente por neutrófilos, macrófagos e linfócitos. A rapidez e a eficácia da resposta imune do hospedeiro contra o patógeno invasor afeta o estabelecimento, a persistência e a gravidade da infecção. Com o objetivo de caracterizar a expressão gênica em animais mestiços e Gir Leiteiro em resposta à mastite foi realizado um estudo de transcriptoma de células presentes no leite de 20 animais mestiços com infecção natural e de 17 vacas Gir infectadas artificialmente com Streptococcus agalactiae. O grupo de animais mestiços era composto por 10 vacas hígidas e 10 vacas com mastite clínica. Neste grupo foi avaliada a expressão relativa dos genes IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-&#947;, TNF- &#945;, TLR-2, SEMA5A e FEZL por meio da metodologia de PCR em Tempo Real. Dentre estes genes, o TLR-2 foi 2,5 vezes mais expresso nos animais com mastite (P < 0,05). Já as amostras do grupo de animais Gir, composto por 17 vacas em lactação, tiveram a expressão avaliada pela técnica de microarranjo e validada por PCR em Tempo Real. Neste caso foram coletadas amostras de leite antes da inoculação (tempo 0), 4, 9 e 24 horas após a inoculação da bactéria em um dos quartos e nos tempos 0 e 24 horas em um dos quartos não inoculado. Foram observados 32 genes diferencialmente expressos entre os tempos 0 e 4 horas após a inoculação pela técnica de microarranjo. A validação destes resultados por PCR em Tempo Real foi feita para os genes AATK, CCL2, CCL20, CD40, CSF2, IL-1&#946;, INHBA e NOS2A. Além destes oitos genes, outros seis tiveram sua expressão avaliada por PCR em Tempo Real, apesar de não terem apresentado diferença significativa pela técnica de microarranjo (IL-12, IL-17, TLR-2, TLR-4, GRO-&#945; e TGF-&#946;1). Dos 14 genes analisados por PCR em Tempo Real, todos apresentaram diferença de expressão significativa em pelo menos um dos contrastes realizados entre os tempos. Esta análise indicou aumento de expressão de todos os genes que apresentaram diferença significativa em relação ao tempo 0, sendo que a maior parte apresentou expressão máxima 24 horas após a inoculação do patógeno. O gene IL-1&#946; apresentou pico de expressão 4 horas após a inoculação, enquanto que os genes CD40 e INHBA mantiveram sua expressão alta por todo o período do experimento. Os genes IL-12 e IL-17 foram os que apresentaram maiores taxas de expressão 24 horas após a inoculação em relação ao tempo 0, com aumento no nível de expressão em mais de 20 vezes. Quando comparada a expressão dos genes entre os quartos inoculados e não inoculados no tempo 24, foi observada maior expressão em nove genes nos quartos inoculados. Análises de redes gênicas identificaram três módulos com características bem distintas entre os tempos 0 e 24 horas e mostraram que alguns mecanismos são alterados em vacas Gir Leiteiro após a infecção da glândula mamária por S. agalactiae. No entanto, é importante ressaltar que estes resultados não podem ser diretamente comparados porque o modo de infecção, os micro- organismos causadores da mastite e as raças foram diferentes nos dois estudos. Mas estes resultados sugerem que os genes que apresentaram diferenças significativas de expressão possivelmente desempenham funções importantes no combate à infecção intramamária, com destaque para o gene TLR-2, o qual apresentou diferença de expressão nos dois estudos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Among the potential public health problems of animal production, infectious- contagious diseases stand out. Mastitis is among the main diseases affecting dairy cattle. It is an inflammatory response in the mammary gland caused by an influx of somatic cells, composed mainly of neutrophils, macrophages and lymphocytes. The speed and efficacy of the host s immune response to the invasive pathogen affects the establishment, persistence and severity of the infection. To characterize the gene expression and response mechanism to mastitis in crossbreed dairy cows and Gyr breed, we carried out a transcriptome study of the cells present in the milk from 20 crossbreed dairy cows with natural infection and 17 Gyr cows artificially infected with Streptococcus agalactiae. The group of crossbreed animals was composed of 10 animals free of infection and 10 with clinical mastitis. This group we quantified the relative expression of the genes IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-&#947;, TNF-&#945;, TLR-2, SEMA5A, and FEZL using the real-time PCR method. Among these genes, the TLR-2 was express 2.5 times more in cows with mastitis (P < 0.05). In turn, the samples of Gyr cows group composed of 17 animals in lactation were evaluated by microarray and validated by real-time PCR technique. For this, we collected milk samples before inoculation (hour 0) and 4, 9 and 24 hours after inoculation of the bacteria on one of the quarters and at 0 and 24 hours from one of the quarters not inoculated. The microarray technique revealed the existence of 32 differentially expressed genes between inoculation and 4 hours afterward. The validation of these results by real- time PCR was done for the genes AATK, CCL2, CCL20, CD40, CSF2, IL-1&#946;, INHBA and NOS2A. Besides these eight genes, the expression of six others was evaluated by real-time PCR even though they did not present a significant difference by the microarray technique (IL-12, IL-17, TLR-2, TLR-4, GRO-&#945; and TGF-&#946;1). Of the 14 genes analyzed by real-time PCR, all showed a significant difference in expression for at least one of the comparisons between times. This analysis indicated an increase in the expression of all the genes that presented a significant difference in relation to hour 0, with most of them presenting maximum expression 24 hours after inoculation of the pathogen. The IL-1&#946; gene showed peak expression 4 hours after inoculation, while the CD40 and INHBA genes maintained their expression throughout the experimental period. The IL-12 and IL-17 genes showed the highest expression rates 24 hours after inoculation in relation to hour 0, with an increase in the level of expression by more than a factor of 20. Comparison of the gene expression between the inoculated and non-inoculated quarters showed greater expression in nine genes in the inoculated quarters. Analyses of gene networks revealed three modules with distinct characteristics 24 hours after inoculation and showed that some mechanisms are altered in Gyr dairy cows after infection of the mammary gland by Strep. agalactiae. However, it is important to emphasize that these results can not be directly compared because the mode of infection, the causative micro-organisms of mastitis and the races were different in the two studies. But these results suggest that the genes that exhibited significant differences in expression may play an important role in combating intramammary infection, particularly the TLR-2, which showed differential expression in both studies.