Cholesterol homeostasis in Development | Molecular cloning and functional characterisation of the Xenopus 7-dehydrocholesterol reductase (Xdhcr7) | Cholesterol-Homöostase in der Entwicklung | Isolation und Characterisierung des

Angeborene Störungen der Cholesterol-Biosynthese werden durch eine Reihe unterschiedlicher Entwicklungsdefekte charakterisiert. Unter den Enzymen, die in die Cholesterol-Biosynthese mit einbezogen werden, ist die Reduktase des 7 Dehydrocholesterol (DHCR7) das spezifische Enzym des Cholesterins, da es den letzen Schritt der Synthese katalysiert, der direkt zum Cholesterol führt. Mutationen im Gen für die DHCR7 sind die Hauptursache des Smith-Lemli-Opitz Syndroms (SLOS), das durch die Dysmorphogenese verschiedener Organe gekennzeichnet ist. Obwohl Daten zunehmen, die zeigen, dass der SLOS Phänotyp möglicherweise auf einen gestörten Hedgehog-Signalweg zurückzuführen ist, ist der molekulare Mechanismus weiterhin Gegenstand intensiver Forschung, der die Cholesterol-Homöostase in der Entwicklung mit einschließt. Es konnten drei Xenopus EST Klone über eine Durchmusterung entsprechender Genbanken identifiziert werden, die eine hohe Homologie zur menschlichen dhrc7 cDNA besaßen. Mittels RT-PCR konnten drei Isoformen der Xenopus DHCR7 isoliert werden, die alle gemeinsam im Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten, wenn diese in Hefen überexprimiert wurden. Die Analyse der embryonalen Expression zeigte eine Expression im Bereich des Spemann Organisators, dem Notochord und später in bestimmten Bereichen des embryonalen Gehirns. Die zeitlich-räumliche Expression sowie die Verteilung der DHCR7-Transkripte in adulten Geweben zeigte eine auffällige Korrelation mit der lokalen Expression von Sonic Hedgehog. Die Überexpression von 2 ng synthetischer RNA der längsten Isoform von DHCR7 führte in der Folge zu einer Entwicklung kleinerer Augen, was einher ging mit dem Verlust placodaler Strukturen, wie durch die Analyse verschiedener neuraler Markergene gezeigt werden konnte. Die Unterdrückung der Translation ("knock-down") durch die Injektion von 1 pmol Xdhr7-Antisense-Oligonukleotide (Morpholinos) führte ebenfalls zur Ausbildung stark verkleinerter Augenanlagen, wahrscheinlich durch eine teilweise Unterdrückung der Neurogenese.

Inborn errors of cholesterol biosynthesis are characterised by multiple developmental defects. Among the enzymes involved in the cholesterol biosynthesis pathway, 7- dehydrocholesterol reductase (DHCR7) is the very cholesterol specific enzyme, as it catalyses the last step leading directly to cholesterol. Mutations in the DHCR7gene are the major cause of the Smith-Lemli-Opitz syndrome (SLOS), which is a multiple dysmorphogenesis syndrome. Although accumulating data suggest an impairment of sonic hedgehog signalling as possible explanation of the SLOS phenotypes, their molecular mechanism is still a matter of investigations, the very role of cholesterol homeostasis in development as well. By database search, three XenopusEST clones were identified, which shared high homology with the human dhcr7 cDNA. By mean of RT-PCR, three alternative spliced isoforms of Xdhcr7 cDNA were isolated, the products of which shared a common sub-cellular localization (Endoplasmic Reticulum), when expressed in yeast. Expression pattern analysis revealed that the embryonic expression of Xdhcr7is restricted to the Spemann organizer, the notochord, and is later mainly evealed in brain structures and derivatives. The temporal expression, as well as the tissue distribution in the adult frog showed that Xdhcr7 transcripts share an interesting correlation with sonic hedgehog, which suggested a role for XDHCR7 activity in pattern formation. Overexpression by injection of 2 ng of the full-length Xdhcr7 capped-mRNA (Xdhcr7-L) leaded to small eye phenotypes, which most likely resulted from a lost of placode structures, as supported by the reduction of the placode expression domains of neural plate markers genes. Knock-down by injection of 1 pmol of Xdhcr7 morpholino leaded to severely reduced eye phenotypes, possibly due to an impairment of the neurulation process, since neural markers gene expression was severely reduced as well. Since the NADPH-dependent reduction of 7-dehydrocholesterol to cholesterol is the only function that has been assigned to DHCR7 proteins so far, these results suggest that the de novocholesterol biosynthesis is essential for organogenesis, and mainly for neural development. Therefore, the homeostatic regulation of cholesterol pool is essential for normal development, since both high cholesterol input and lowered cholesterol content resulted in the impairment of development. This data present the first description of the expression pattern of dhcr7 during early development which,together with the lost- and gain- of function data strongly suggest a spatially restricted requirement for cholesterol production.