Langzeitversuche zur Latenz von Xanthomonas campestris pv. pelargonii und Vergleich mikrobiologischer, serologischer und molekulargenetischer Nachweisverfahren | Long-term studies on latency of Xanthomonas campestris pv. pelargonii and comparison of microbiological, serological and molecular genetic detection methods

Für die Untersuchung der Latenz in einem Langzeitversuch von 68 Monaten wurden die Pelargoniensorten Rosario und Isabell am Stengel mit einer Bakteriensuspension von 3 verschiedenen, aber sehr niedrigen Konzentrationen inokuliert. Bei 25 °C erkrankten die Pflanzen zunächst innerhalb von 6 Monaten viel schneller als bei 15 °C. Bei 15 °C erfolgte die Erkrankung zwar langsamer, aber kontinuierlicher, so dass am Ende des Versuches (nach 68 Monaten) deutlich mehr Pflanzen erkrankt waren, d. h. die niedrigere Temperatur förderte die Latenz. Bei der wärmeren Temperatur starben die inokulierten Bakterien in denjenigen Pflanzen, in denen sie nicht innerhalb von 11 Monaten eine Erkrankung ausgelöst hatten, ganz ab. Im Versuchszeitraum ergab sich eine maximale Latenzperiode von 57 Monaten, d. h., in einer Pflanze konnten die Bakterien, ohne Krankheitssymptome auszulösen, fast 5 Jahre unerkannt überleben. Durch intensive Düngung wurde das Durchbrechen der Latenzperiode gefördert. Hohe Bakterienkonzentrationen wurden besonders in den Stengelnodien, aber auch in den Blüten und Wurzeln gefunden. Auch bei Latenz konnten die Bakterien systemisch in der Pflanze verbreitet sein und dann unerkannt durch Stecklinge übertragen werden. Auf den Blättern konnten die Bakterien bis zu 2,5 Monate epiphytisch überleben, bis sie die Pflanze systemisch besiedelten. Auch Begießen der Topferde mit Bakteriensuspension führte zur Erkrankung. Auch im Sickerwasser aus infizierten Topf-Pflanzen wurden die Bakterien in Konzentrationen bis zu 104 4 cfu/ml nachgewiesen.Drei mit Pelargonien verwandte Pflanzenarten (Erodium cicutorium, Geranium dissetum, Geranium pusillum) waren anfällig für Xcp und zeigten 12 Tage nach Inokulation typische Krankheitssymptome und hohe Bakterienkonzentrationen ( 108 cfu/g) im Stengel. Bei Geranium pusillum wurden die Bakterien auch im Samen nachgewiesen.Zum schnellen und sicheren Nachweis von Xcp in Pflanzen wurden 2 neue semiselektive Nährmedien entwickelt, das Tween-Cellobiose-Medium mit den Antibiotika Cephalexin, 5-Fluorouracil, Tobramycin und Cycloheximid und das MD5A-Medium mit Cellobiose, Glutaminsäure, Methionin und den Antibiotika Cephalexin, Bacitracin und Aztreonam sowie Bromthymolblau.Für einen schnellen Nachweis der Bakterien im Routineverfahren durch den ELISA wurden 5 verschiedene Seren verglichen. Die höchste Nachweisempfindlichkeit zeigte ein polyklonales Antiserum vom IPO (Niederlande). Auch in teilweise verholzten Pelargonienstengeln, die seit 4 Jahren latent mit Xcp infiziert waren, konnten die Bakterien nachgewiesen werden. Nach Inkubation des Pflanzenextraktes für 24 h in TC-Lösung (Zwischenvermehrung der gesuchten Bakterien) konnte noch eine ursprüngliche Konzentration von 10² cfu/ml in der Pflanze nachgewiesen werden. Durch den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde eine Nachweisgrenze im Pflanzenextrakt von 103 bis 104 cfu/g Frischgewicht erreicht. Mit der Bio-PCR (Zwischenvermehrung, s.o.) konnte die Nachweisempfindlichkeit auf 103 cfu/ml gesenkt werden. Im Vergleich mit den beiden indirekten Nachweismethoden (ELISA und PCR) sollte jedoch der direkte mikrobiologische Nachweis mit einem semiselektiven Nahrmedium nicht ausgeschlossen werden, da er sicher und kostengünstig ist.

For realising a fast and reliable detection of Xanthomonas campestris pv. pelargonii (Xcp) in plant material, two new semi-selective media were developed, the Tween-cellobiose-medium with the antibiotics Cephalexin, 5-Fluorouracil, Tobramycin and Cycloheximid and the MD5A-medium with cellobiose, glutamic acid, methionine and the antibiotics Cephalexin, Bacitracin and Aztreonam, and with bromothymol blue. For a quick estimation of bacterial content in a routine assay by the ELISA procedure 5 different Xcp-antisera were tested under standardized conditions. These tests revealed considerable differences in suitability of the sera. Highest sensitivity was recorded for a polyclonal antiserum from IPO, Netherlands. Even in partially lignified old pelargonium stems which were latently infected with Xcp for 4 years, the bacteria could be detected by this serum. After incubating plant extract in the Tween-cellobiose-medium for 24 h (intermediate multiplication of the target bacterium) an original concentration of 102 cfu/ml plant extract could be detected.By applying the polymerase chain reaction (PCR) the detection limit was 103 - 104 cfu/g fresh weight. This could be lowered to 103 cfu/g by Bio-PCR. When compared to the two indirect detection methods (ELISA and PCR) the direct microbiological detection on a semi-selective medium should not be neglected since it is very reliable and inexpensive.For studying the latency phenomenon of Xcp, long-term inoculation experiments enduring 68 months were carried out. Young plants of the pelargonium cultivars "Rosario" and "Isabell" were stem-inoculated with a bacterial suspension of 3 different very low concentrations. At 25 °C disease symptoms appeared within 6 months and much faster as when the plants were kept at 15 °C. At 15 °C the disease appeared slower but more continuously, so that at the end of the experiment (after 68 months) more plants were diseased at 15 ° than at 25 °C. Obviously, the low temperature supported a latent infection of the plants. At the higher temperature of 25 °C all the inoculated bacteria died in those plants where they did not cause disease within 11 months. This was not the case in the plants kept at the lower temperature of 15 °C.In these experiments the longest latent infection period recorded was 57 months. This means that the bacteria survived without causing disease symptoms for nearly 5 years in the same plant. Intensive fertilization caused appearance of disease symptoms in latently infected plants. Especially high bacterial concentrations were recorded in the stem nodium, but also in flowers and roots. In latently infected plants bacteria were able to colonize the plant systemically, so that the bacteria were transmitted undetectedly by cuttings. On leaf surfaces bacteria could survive epiphytically up to 2,5 months before colonizing the plant systemically. Also watering potted plants with bacterial suspensions led to the disease. The water leaking out of pots with disease plants contained up to 104 Xcpcfu/ml.Three plant species related to pelargonium (Erodium cicutorium, Geranium dissetum, and Geranium pusillum) were susceptible towards Xcp and developed typical disease symptoms within 12 days after inoculation with high bacterial concentrations in the stem (108 cfu/g). In Geranium dissetum the bacteria were also detected in the seeds.