Reduktion von Escherichia coli durch den Einsatz von Bakteriozinen | Reduction of Escherichia coli by bacteriocins

Mit pathogenen Mikroorganismen kontaminierte Lebensmittel können zu schwerwiegenden Erkrankungen führen und stellen ein Risiko für den Verbraucher dar. Dabei haben vor allem Lebensmittel tierischen Ursprungs ein hohes Übertragungspotential von Lebensmittelerregern auf den Menschen. Lebensmittelassoziierte Krankheitserreger wie Escherichia (E.) coli spielen eine bedeutende Rolle als Verursacher von Lebensmittelinfektionen beim Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Antibiotika zur Bekämpfung bakterieller Infektionen wird die Entwicklung von Resistenzen gefördert. Bakteriozine stellen als antimikrobielle Proteine eine vielversprechende Alternative dar, weil sie nicht toxisch auf eukaryotische Zellen wirken und ubiquitär in der Umwelt und somit auch natürlicherweise im Lebensmittel vorkommen. Die von E. coli produzierten Colizine und Mikrozine gelten als große Hoffnung pathogene E. coli im Lebensmittel zu reduzieren. Ziel dieser Arbeit war es, E. coli-Isolate aus Lebensmittelproben auf das Vorhandensein von Bakteriozinen im Spot-Assay zu untersuchen und die Bakteriozinbildner anschließend weitestegehend zu charakterisieren. Dafür wurde mittels PCR zum einen auf das Vorhandensein bekannter Colizin- und Mikrozin-Gene und zum anderen die Einteilung der Isolate in bestimmte Phylogruppen untersucht. Darüber hinaus erfolgte eine Bestimmung des Molekulargewichtes der Bakteriozinextrakte mittels SDS-PAGE. Mittels Zellzahlreduktions-versuchen wurde der Einsatz von Colizinen im Nährmedium und im Lebensmittel untersucht. Aus verschiedenen Lebensmittelamatrices konnte bei 97,5 % der Proben E. coli isoliert und mittels MALDI-TOF MS-Analyse bestätigt werden. Dabei wurden 51,3 % der E. coli-Isolate aus Fleisch isoliert. Mindestens einen Referenzstamm lysierten 52,5 % der isolierten E. coli im Spot-Assay, wobei der Referenzstamm E. coli K-12 DH5α die höchste Sensitivität aufwies. Die Colizin-Gene B, E7 und Ia konnten am häufigsten bei den untersuchten lysierenden E. coli-Isolaten aus Lebensmitteln nachgewiesen werden. Die E. coli-Isolate wurden überwiegend den Phylogruppen A (37,5 %) und B1 (36,3 %) zugeordnet. Neun der 33 untersuchten Proteinextrakte zeigten eine Lyse-Bande zwischen 55 und 75 kDa auf dem Overlay-Agar des inkubierten SDS-Gels. Nach Detektion von Bakteriozinbildnern und Charakterisierung der Bakteriozine, wurde ein Bakteriozin-Konzentrat hergestellt. In Versuchen wurde anschließend ermittelt, ob dieses Konzentrat in der Lage ist, den Referenzstamm E. coli K-12 DH5α unter definierten Bedingungen zu reduzieren. Das Konzentrat wurde aus der Übernachtkultur des E. coli 2116-Isolates hergestellt. Das Isolat wies Gene für die Colizine E2 und K sowie für das Mikrozin B17 auf. Die E. coli 2116 Übernachtkultur wurde mittels Tangentialflussfiltration bei einem Cut Off von 100 kDa filtriert und bei einem Cut Off von 30 kDa aufkonzentriert. Nach unmittelbarer Zugabe des E. coli 2116-Konzentrats konnte die Zellzahl von E. coli K-12 DH5α von 107 KbE/ml sowohl bei 37°C als auch bei 4°C-Umgebungstemperatur um sechs Log-Stufen reduziert werden. Bei 37°C Umgebungstemperatur stieg die Zellzahl innerhalb von 24 h wieder auf 108 KbE/ml an. Bei 4°C Umgebungstemperatur blieb die Zellzahl über die Gesamtversuchsdauer konstant bei 101 KbE/ml. Der Einsatz von Bakteriozinen zur Reduktion von E. coli-Zellzahlen ist im Nährmedium bei einer Umgebungstemperatur von 4°C gut geeignet. Bei der Zugabe von E. coli 2116-Konzentrat zu Hackfleisch kam es abhängig vom eingesetzten Volumen des Konzentrates zu Reduktionen von einer Log-Stufe bis unterhalb der Nachweisgrenze. Je höher verdünnt das Konzentrat eingesetzt wird, desto weniger Bakteriozine sind im Ansatz vorhanden, weshalb die Reduktion schwacher ausfällt. Vermutlich kommt es zusätzlich zu Wechselwirkungen zwischen Bakteriozinen und Bestandteilen des Fleisches. Für zukünftige Versuche sollten deshalb verschiedene Bakteriozinkonzentrate auf unterschiedlichen Lebensmittelmatrices getestet werden. Außerdem sollten Versuche durchgeführt werde, welche die Mechanismen und Wechselwirkungen zwischen Bakteriozinen und verschiedenen Matrices genauer untersuchen.

Contaminated food containing pathogenic microorganisms can lead to serious illnesses and pose a risk for consumers. Food of animal origin has a high transmission potential for food pathogens. Food-related pathogens such as Escherichia (E.) coli play an important role in causing food infections in humans. This has resulted in an increasing use of antibiotics which led to a higher rate of antibiotic resistance. Bacteriocins are antimicrobial proteins produced by bacteria. They are a promising alternative to antibiotics because they lyse their own or closely related species. They have no toxic effects on eukaryotic cells and are ubiquitous in the environment and therefore naturally present in food. Colicins and microcins, produced by E. coli, are a promising alternative to reduce pathogenic E. coli in food. The aim of this study was to examine E. coli isolates from food samples for their ability to produce bacteriocins. The bacteriocin production was tested in a spot assay and the bacteriocin producers were then further characterized by PCR for the presence of known colicin and microcin genes. Furthermore, a phylogroup determination was carried out by PCR and the molecular weight of the bacteriocin extracts was determined by SDS-PAGE. E. coli was isolated from different food matrices and 97,5 % of the isolates were confirmed by MALDI-TOF MS analysis. Most of the isolates (51,3 %) were found in meat samples. At least one reference strain was lysed bei 52,5 % of the E. coli isolates in the spot assay, in which the reference strain E. coli K-12 DH5α showed the highest sensitivity. The colicin genes B, E7 and Ia were the most frequently detected genes and the E. coli isolates were mainly assigned to phylogroups A (37,5 %) and B1 (36,3 %). Nine out of 33 protein extracts showed a lysis band between 55 and 75 kDa on the overlay agar of the incubated SDS-PAGE-gel. After the detection of bacteriocin producers and characterization of the bacteriocins, a bacteriocin concentrate was produced. Tests were then carried out to determine whether this concentrate is able to reduce the reference strain E. coli K-12 DH5α defined conditions. The concentrate was prepared from the overnight culture of the E. coli 2116 isolate. The isolate showed genes for the colicins E2 and K as well as for the microcin B17. The E. coli 2116 overnight culture was filtered by tangential flow filtration at a cut off of 100 kDa and concentrated at a cut off of 30 kDa in order to obtain the colicin concentrate. After the immediate application of the E. coli 2116 colicin concentrate, the cell number of E. coli K-12 DH5α (107 CFU/ml) was reduced by six log units at 37°C and at 4°C. At 37°C, the cell number increased again within 24 h to 108 CFU/ml. At 4°C, the cell number remained constant at 101 CFU/ml for the entire test period. The usage of bacteriocins to reduce E. coli cell numbers in culture medium is possible at storage temperatures around 4°C. Using E. coli 2116 colicin concentrate in minced meat led to a reduction from one log unit till a reduction below the detection limit. The effect was dependent on the applied volume of the E. coli 2116 colicin concentrate. The more diluted the concentrate is being used, the fewer bacteriocins might be available. It is reasonable to assume that there might be interactions between bacteriocins and meat components. In future studies, different bacteriocin concentrates should be tested on various food matrices. Furthermore, their mechanisms and interactions with food matrices should be examined in detail.