Einfluss experimentell modifizierter LTBP-4-Genexpression auf das Expressionsprofil von TGF-β1, p21 und c-myc in HEK293T Zellen | In vitro - investigations of the influence of altered gene expression of the TGF-β-binding protein LTBP-4 on the expression pattern of the tumorsuppressive CDKIs

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Die Expression von Genen, die Zellwachstum und -proliferation regulieren, ist bei Krebserkrankungen verändert oder mutiert und führt zu unkontrollierter Zellzyklus-Progression. Zu den potentesten Wachstumsregulatoren zählen sowohl TGF-β1 als auch p21 und c-myc. TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) reguliert in Assoziation mit seinem Bindungsprotein sLTBP-4 (»short form« des Latent TGF-β Binding Protein 4), das als wichtigster Modulator der TGF-β1-Bioverfügbarkeit gilt, verschiedenste Funktionen in epithelialen Zellen, wobei seine antiproliferative und somit tumorsuppressive Wirkung eine Hauptfunktion darstellt. Ein Mangel an TGF-β1 führt sowohl zu einer reduzierten Expression des tumorsuppressiven CDKI (Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren) p21, als auch zu einer vermehrten Expression des Protoonkogens c-myc. Beide Mechanismen bedingen sich gegenseitig, sind somit prokanzerogen und induzieren eine verstärkte und ungehemmte Proliferation epithelialer Zellen. In einem in vitro-Modell mit der epithelialen Zelllinie HEK293T wurde in der vorliegenden Arbeit mittels quantitativer Expressionsanalyse untersucht, inwiefern p21 und c-myc in Zellen mit einer modulierten LTBP-4-Expression einer differentiellen Expression unterliegen. Ziel war hierbei das nähere Verständnis der Korrelation des TGF-β1-Bindungsproteins LTBP-4 mit dem CDKI p21 und dem Protoonkogen c-myc in der Karzinogenese epithelialer Zellen. Im Rahmen der molekularbiologischen Untersuchungen wurde zunächst das Genesilencing sowie die Überexpression des sLTBP-4-Gens in HEK293T-Zellen etabliert. Die Ergebnisse der proteinbiochemischen Untersuchungen ergänzten auf qualitativer Basis den molekularbiologischen, quantitativen Nachweis einer erfolgreichen sLTBP-4-Überexpression in HEK293T Zellen. In diesen Zellen wurde das sL4-V5-Fusionsprotein regelmäßig detektiert, was eine erfolgreiche Translation dokumentiert. In den folgenden qPCR-Analysen unterlagen die Gene TGF-β1, p21 und c-myc im vorliegenden in vitro - Modell des sLTBP-4-knock-down entgegen den Erwartungen keiner Expressionsregulation. In sLTBP-4-überexprimierten Zellen wurde eine vermehrte Genexpression von TGF-β1 und p21 sowie eine verminderte c-myc-Expression wie erwartet festgestellt. Die Ergebnisse zeigen somit eine Wechselbeziehung der untersuchten Zielgene im sLTBP-4-Überexpressionsmodell und verdeutlichen deren Expressionskorrelation in der Karzinogenese epithelialer Tumoren.

The expression of genes regulating cell growth and proliferation, such as TGF-β1, p21, and c-myc, can be altered or modified in the process of carcinogenesis in epithelial tumors and therefore results in uncontrolled cell cycle progression. TGF-β1 (transforming growth factor beta 1) in association to its binding protein sLTBP-4 (»short form« of latent TGF-β binding protein 4) which is an important modulator of TGF-β1-bioavailability regulates different functions in epithelial cells. Its antiproliferative and therefore tumorsuppressive effects represent a major cellular function. A reduced availability of TGF-β1 results in reduced expression of tumorsuppressive CDKI`s (cyclin dependent kinase inhibitors), in particular p21, as well as in augmented expression of protooncogenes, in particular c-myc. Both mechanisms depend on each other, are procancerogenic and induce enhanced and unarrested proliferation of epithelial cells. In the present project it was analyzed using an in vitro model with the epithelial cell line HEK293T, wether p21 and c-myc in cells with altered LTBP-4-expression undergo a differential expression pattern themselves. The aim of this project was to get a closer insight into the correlation of the TGF-β binding protein LTBP-4 with the CDKI p21 and the protooncogene c-myc during the carcinogenic process of epithelial cells. Gene silencing as well as transient overexpression of the sLTBP-4-gene in HEK293T cells was established under in vitro conditions. The quantitative molecular biological proof of sLTBP-4 overexpression in HEK293T cells through qPCR inquisition was supported by western blot analysis. These proteinbiochemical investigations completed the qPCR survey on a qualitative basis. The sL4-V5 fusion protein was regularly detected, which documents a successful translation. The following qPCR analysis showed contrary to the expectations that there was no regulation of expression of the genes TGF-β1, p21, and c-myc in the model of sLTBP-4-knock-down. Further on it was expected to detect an enhanced gene expression of TGF-β1 and p21, as well as a reduced expression of c-myc in sLTBP-4-overexpressed cells. In this case the analysis showed an upregulation of TGF-β1- as well as p21-expression and a slightly reduced expression of the c-myc-gene. The results of this study indicate a correlation of the tested target genes in the model of sLTBP-4-overexpression and clarify their interdependency in the process of carcinogenesis in epithelial neoplasia.