Molecular Epidemiology and Vertical Transmission of ESBL-/AmpC-producing Enterobacteriaceae along the Broiler Production Chain | Molekulare Epidemiologie und vertikale Transmission von ESBL-/AmpCproduzierenden Enterobacteriaceae entlang der Masthähnchenproduktionskette

Enterobacteriaceae which demonstrate resistance against beta-lactam antibiotics are of major concern in public health. The occurrence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-/AmpC betalactamase-producing E. coli in humans and animals is a challenging problem in antibiotic treatment in human and veterinary medicine. Especially in broiler chickens these resistant bacteria were frequently detected and a certain relevance of the exposure of contaminated chicken meat to humans is controversially discussed during the last decades. However, is was found, that ESBL-/pAmpC-producing Enterobacteriaceae were detectable on all stages of the broiler production and that already one-day old (grand-/parent)chicks can be affected. During the RESETII-project we therefore investigated seven ESBL-/pAmpC-positive parent broiler flocks, their respective hatching eggs as well as the subsequent broiler fattening flocks at the fattening farms as well as on slaughterhouse level concerning the occurrence of the resistant bacteria (chain investigations A-G). This project was performed by the Institute for Animal Hygiene and Environmental Health as well as the Institute of Food Safety and Food Hygiene from the Freie Universität Berlin. The task of the presented PhD thesis was to investigate the collected samples and resistant strains with regard to possible vertical transmission events in the whole broiler production chain. Therefore, high resolution molecular methods like pulsed-field gel-electrophoresis (PFGE) as well as whole genome sequencing (WGS) was applied to the respective isolates to determine their phylogenetic relationship. Using these methods, it could be shown that the introduction of the ESBL-/pAmpCproducing Enterobacteriaceae from the parent flocks into the hatchery occurred via contaminated egg shells (pseudo-vertical transmission) and that these bacteria can also survive the disinfection procedure. The hatchery acts as a reservoir for the resistant bacteria and certain strains are stepwise transmitted to the recently hatched chicks via the hatchery environment. However, the colonization of the chicks can also occur later on at the fattening farms. This indicates that the transmission routes of the ESBL-/pAmpC-producing Enterobacteriaceae in the broiler production are highly complex. Once the broiler chickens are infected with the resistant bacteria they directly introduce them into the slaughterhouse and the processing steps of the chicken meat. Especially the scalding and the defeathering steps are critical for cross-contamination events as shown in this study. Furthermore, selected isolates from all stages of the broiler production where investigated concerning the occurrence of virulence associated genes (VAGs) and the ability to produce curli fibers and cellulose. These factors support the colonization of a respective host as well as the survival in unfavorable environmental conditions. Using a macrocolony assay it could be shown that most of the tested E. coli isolates were able to produce curli fibers and cellulose which are the major components of biofilms. Therefore, it is very likely that these ESBL-/pAmpC-producing E. coli strains are also highly resistant against environmental stress and for example might also better survive certain cleaning and disinfection procedures. In addition, the investigated E. coli strains also showed up to harbor high numbers of VAGs. However, the numbers and the distribution of certain genes and virulence gene classes varied among the strains. Therefore, no specific VAG could be identified for the enhanced survival in broiler chickens. Furthermore, only isolates of one chain transmission investigation could be assigned as extra-intestinal pathogenic E. coli strains (ExPEC). This indicates that further investigations on the impact of certain bacterial factors on the survival, spread and transmission of ESBL-/pAmpC-producing E. coli in the broiler production chain are needed. For the successful development and application of intervention strategies against these resistant bacteria in the whole broiler production chain the complex network of transmission routes as well as supporting bacterial factors should be considered. Therefore, further detailed studies using an appropriate high number of samples and isolates as well as respective high resolution molecular methods need to be carried out.

Enterobacteriaceae, welche eine Resistenz gegenüber Beta-Laktam Antibiotika aufzeigen, sind ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Das Vorkommen von Extended-Spektrum Beta-Laktamase (ESBL)-/AmpC Beta-Laktamase-produzierenden E. coli in Mensch und Tier ist eine Herausforderung für die Behandlungsstrategien in der Human- und Veterinärmedizin. Besonders in Masthähnchen finden sich diese resistenten Bakterien und daher wird auch dem kontaminierten Hühnchenfleisch eine große Bedeutung zugemessen bei einer möglichen Übertragung auf den Menschen. Dieses Thema wird in den letzten Jahren jedoch auch sehr kontrovers diskutiert. Es konnte gezeigt werden, dass ESBL-/AmpC-produzierende Enterobacteriaceae sich in allen Stufen der Masthähnchenproduktionskette nachweisen lassen und dass auch bereits Eintagsküken kolonisiert sein können. Innerhalb des RESETII-Projektes wurden daher sieben ESBL-/pAmpC-positive Elterntierherden, deren Bruteier und die zugehörigen Masttierherden auf den Farmen und im Schlachthof bezüglich des Vorkommens dieser resistenten Bakterien untersucht (Kettenuntersuchungen A-G). Das Projekt wurde in den Instituten für Tier- und Umwelthygiene sowie für Lebensmittelsicherheit und –hygiene der Freien Universität Berlin durchgeführt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die gesammelten Proben und resistenten Stämme insbesondere hinsichtlich möglicher vertikaler Übertragungswege innerhalb der Masthähnchenproduktionskette untersucht. Dabei wurden hochauflösende molekulare Methoden wie pulsed-field Gelelektrophorese (PFGE) und Ganzgenomsequenzierung (WGS) verwendet um die phylogenetische Verwandtschaft der untersuchten Isolate zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass der Eintrag der ESBL-/AmpC produzierende Enterobacteriaceae von den Elterntierherden in die Brüterei über kontaminierte Bruteioberflächen erfolgt (pseudovertikale Übertragung) und dass diese Bakterien auch die Desinfektionsmaßnahmen in der Brüterei überleben können. Die Brüterei fungiert dann als Reservoir für die resistenten Bakterien und einzelne Stämme werden nach und nach durch die Umgebung auf die geschlüpften Küken übertragen. Die Kolonisierung der frisch geschlüpften Küken kann aber auch erst im späteren Verlauf direkt auf der Mastfarm erfolgen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Möglichkeiten der Übertragungen von ESBL-/AmpC-produzierenden Enterobacteriaceae in der Masthähnchenproduktionskette sehr komplex sind. Sind die Masthähnchen jedoch einmal mit den resistenten Keimen kolonisiert, erfolgt ein direkter Eintrag in den Schlachthof und in die einzelnen Verarbeitungsschritte von Hähnchenfleisch. Insbesondere der Brühprozess und der Rupfvorgang sind kritische Schritte in Bezug auf mögliche Kreuzkontaminationen, wie in der vorliegenden Studie gezeigt werden konnte. Zusätzlich wurden ausgewählte Isolate aus allen Produktionsstufen der Masthähnchenkette auf das Vorkommen von Virulenz-assoziierten Genen (VAGs) hin untersucht sowie auf die Fähigkeiten Curli-Fimbrien beziehungsweise Zellulose zu produzieren. Diese Faktoren unterstützen die Kolonisierung eines entsprechenden Wirts und das Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen. Mit Hilfe eines Makrokolonieassays konnte gezeigt werden, dass die Mehrheit der untersuchten Isolate die Fähigkeit zur Bildung von Curli-Fimbrien und Zellulose besitzen, welche die Hauptkomponenten von bakteriellen Biofilmen darstellen. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass diese ESBL-/AmpC-produzierenden Enterobacteriaceae eine hohe Widerstandskraft gegen Umweltstress und beispielsweise auch gegen die Reinigungs- und Desinfektionsvorgänge aufweisen. Zusätzlich besaßen die untersuchten Isolate eine hohe Anzahl an VAGs in ihren Genomen. Die Gesamtzahl dieser VAGs sowie die Verteilung der VAGs unterschiedlicher Genkategorien variierten jedoch zum Teil zwischen den Stämmen. Es konnte daher kein spezifischer Faktor identifiziert werden für die Kolonisierung von Masthähnchen. Außerdem konnten nur Isolate aus einer einzigen Kettenuntersuchung als sogenannte extra-intestinal pathogene E. coli (ExPEC) ausgemacht werden. Das zeigt, dass weitere Untersuchungen benötigt werden, bezüglich der Überlebensmöglichkeiten, der Verbreitung und der Übertragung von ESBL-/AmpC-produzierenden E. coli innerhalb der Masthähnchenproduktionskette. Für die Entwicklung und erfolgreiche Anwendung von Interventionsmaßnahmen gegen diese resistenten Bakterien in der Masthähnchenproduktionskette sollten das komplexe Übertragungsnetzwerk sowie bestimmte bakterielle Faktoren mit in Betracht gezogen werden. Dazu bedarf es weiterer detaillierter Studien mit einer entsprechenden Anzahl an Proben und Isolaten und die Anwendung von hochauflösenden molekularen Methoden.