Analyse putativer Inhibitoren von Anthelminthika-Resistenz-Mechanismen in gastrointestinalen Nematoden des Rindes | Analysis of putative inhibitors of anthelmintic resistance mechanisms in cattle gastrointestinal nematodes

Infections of the gastrointestinal tract with parasitic nematodes in livestock animals lead to significant impact in animal health and welfare and to enormous economic damage. The therapeutic agents commonly used for the control of gastrointestinal (GI) parasites can be divided into three main chemical groups: the benzimidazoles (BZs), the macrocyclic lactones (MLs) and the imidazothiazoles. Resistance to all three drug classes jeopardises chemical control of GI nematodes in livestock, particularly in countries with intensive grazing. While facing increasing resistance worldwide, knowledge of the mechanism of action of the currently used anthelmintics is crucial in order to develop strategies for their sustainable use. While mutations in the β-tubulin coding sequences have been detected to confer resistance to BZs, the resistance mechanism of the MLs still remains mainly unknown. Apart from specific resistance mechanisms (e.g. glutamate gated chloride channels), P-glycoproteins (Pgps), transmembrane proteins belonging to the family of multidrug transporters (ABC-transporters) and enzymes of the cytochrome P450 family (CYP P450s) have been reported to be involved in resistance to MLs. The effects of the Pgp inhibitor verapamil (VPL) and the CYP P450 inhibitor piperonyl butoxide (PBO) on the efficacy of ivermectin (IVM), thiabendazole (TBZ) and levamisole (LEV) were studied in vitro in susceptible and resistant isolates of the cattle parasitic nematodes Cooperia oncophora and Ostertagia ostertagi. The effects of the combined use of drugs and inhibitors on egg hatching, larval development and larval motility were investigated in the egg hatch assay (EHA), the larval development assay (LDA) and the larval migration inhibition assay (LMIA). In the present study it was shown, that all three in vitro tests are suitable for the detection of resistance against MLs and BZs. Resistance to LEV was not further investigated due to the lack of a resistant isolate. In the EHA, the addition of VPL caused almost no changes regarding the inhibitory effect of TBZ on egg hatching in the susceptible isolates of both parasite species. A minor but not significant effect appeared in a C. oncophora isolate resistant to MLs and in the BZ-selected O. ostertagi isolate. A significant inhibitory effect was obtained in the multi-resistant C. oncophora isolate where resistance to BZs was completely reversed. In contrast, the doseresponse- curve of TBZ was shifted to the left in the presence of PBO in all tested isolates, demonstrating an increase in susceptibility towards TBZ. In the LDA, both TBZ and IVM had a potent and significantly increased inhibitory effect on larval development in the presence of VPL and PBO. While the shift in the dose-responsecurves of TBZ using VPL and PBO in the EHA changed with the degree of resistance of the isolate tested, similar EC50 values were obtained across all isolates tested in the LDA, indicating an increase in susceptibility to the tested anthelmintics by 15-270 fold for TBZ and 231-1694 fold for IVM. The LMIA revealed that the use of VPL in combination with IVM led to changed responses of larval migration which was generally similar to that observed in the LDA. However, the susceptibility to the tested anthelmintics was here only increased 2-27 fold, indicating that uptake or intake of the inhibitory substances is lower than in earlier developmental stages of the nematodes life cycle. A change of the inhibitory effect of IVM in the presence of PBO on larval migration was observed only at the highest concentration (85 μg/ml PBO) used for all isolates tested in the assay. The effect of the addition of VPL to the tested anthelmintics appeared more pronounced in the LDA than in the LMIA. For LEV with VPL, only a minor inhibitory effect was detected. The effect of the addition of PBO was most apparent in the EHA and LDA and only present to a lesser extend in the LMIA. In the present thesis the three in vitro tests EHA, LDA and LMIA were successfully employed to study the effect of inhibitors of putative unspecific anthelmintic resistance mechanisms in gastrointestinal nematodes of cattle. Further studies for the detection of anthelmintic resistance in more resistant nematode populations and the identification and characterization of Pgps and CYPs involved in AR are required in order to improve options to reduce the development of anthelmintic resistance.

Infektionen des Magen-Darm-Trakts mit Nematoden bei Nutztieren führen zu erheblichen Auswirkungen im Bereich der Tiergesundheit und zu enormen wirtschaftlichen Schäden. Die therapeutischen Mittel, welche häufig für die Kontrolle der Magen-Darm-Parasiten verwendet werden, können in drei chemische Hauptgruppen unterteilt werden: die Benzimidazole (BZ), die Makrozyklischen Laktone (MLs) und die Imidazothiazole. Sich ausbildende Resistenzen gegen alle drei Substanzklassen gefährden die chemische Kontrolle von Magen-Darm- Nematoden in Tierbeständen, insbesondere in Ländern mit intensiver Weidewirtschaft. Vor dem Hintergrund sich rasant ausbreitender Anthelminthika- Resistenzen weltweit ist die Kenntnis der Wirkungsweise der derzeit verwendeten Anthelminthika entscheidend, um Strategien für ihre nachhaltige Nutzung zu entwickeln. Während Mutationen im für das β- Tubulin kodierenden Gen nachgewiesen wurden, welche mit BZ-Resistenz korrelieren, ist der Resistenzmechanismus der MLs noch immer weitgehend unbekannt. Abgesehen von den spezifischen Resistenzmechanismen (z. B. Glutamat-gesteuerten Chloridkanälen) wurden auch P-Glykoproteine (Pgps), Transmembranproteine aus der Familie der Multi-Drug- Transporter (ABC-Transporter), und Enzyme der Cytochrom-P450-Familie (CYP P450) mit der Resistenz gegen MLs in Verbindung gebracht. Die Auswirkungen des Pgp-Inhibitors Verapamil (VPL) und des CYP P450-Hemmers Piperonyl butoxid (PBO) auf die Effektivität von Ivermectin (IVM), Thiabendazol (TBZ) und Levamisol (LEV) wurden in vitro in empfindlichen und resistenten Isolaten der Rindernematoden Cooperia oncophora und Ostertagia ostertagi untersucht. Die Effekte der kombinierten Verwendung von Anthelminthikum und Inhibitor auf den Larvenschlupf, die Larvenentwicklung und Migrationsfähigkeit von Larven wurden im Larvenschlupfhemmtest (LSHT), Larvenentwicklungshemmtest (LEHT) und Larvenmigrationsinhibitionstest (LMIT) untersucht. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass alle drei in vitro-Verfahren für den Nachweis der Resistenz gegen MLs und BZs geeignet sind. Resistenzen gegen LEV wurden aufgrund der Nichtverfügbarkeit von resistenten Isolaten nicht weiter untersucht. Im LSHT wurde durch die Zugaben von VPL fast kein vermehrt hemmender Effekt der verwendeten Anthelminthika auf die Schlupfrate der empfindlichen Isolate beider Parasitenspezies beobachtet. Ein geringer, aber nicht signifikanter Effekt konnte in einem IVM-resistenten C. oncophora Isolat und in einem auf BZ-Resistenz selektierten O. ostertagi Isolat nachgewiesen werden. Eine signifikante Wirkung wurde bei der Verwendung des multiresistenten C. oncophora Isolates nachgewiesen, wo die Resistenz gegenüber MLs und BZs fast vollständig aufgehoben werden konnte. Im Gegensatz dazu wurden in Gegenwart von PBO die Dosis-Wirkungs-Kurven von TBZ in allen getesteten Isolaten nach links verschoben, was für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber diesen Stoffen spricht. Im LEHT wurde durch Einsatz beider Inhibitoren, VPL und PBO, eine potente und signifikante Steigerung der Anthelminthikawirkung auf die Entwicklung der Larven beobachtet. Während sich die Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurven in Gegenwart von VPL und PBO im LSHT mit dem Grad der Resistenz des getesteten Isolates veränderte, wurden im LEHT extrem ähnliche EC50-Werte für alle Isolate erzielt, wobei die Empfindlichkeit gegenüber den getesteten Anthelminthika 15-270 fach für TBZ und 231-1694 fach für IVM erhöht wurde. Die Ergebnisse im LMIT ergaben, daß die Wirkung von VPL auf die Hemmung der Migrationsfähigkeit der Larven durch die Anthelminthika im Allgemeinen ähnlich zu der im LEHT war. Allerdings war die Empfindlichkeit gegenüber den getesteten Anthelminthika hier nur etwa 2-27-fach erhöht was dafür spricht, dass die Aufnahme der hemmenden Substanzen in L3 geringer ist als die in früheren Entwicklungsstadien. Der Effekt von PBO auf die Wirkung von IVM konnte nur bei der höchsten eingesetzten Konzentration (85 μg/ml PBO) bei allen in diesem Test verwendeten Isolaten beobachtet werden. Der Effekt von VPL war im LEHT deutlicher ausgeprägt als im LMIT. Für die Kombination mit LEV konnte nur eine geringradige Steigerung der hemmenden Wirkung nachgewiesen werden. Der Effekt von PBO war am deutlichsten im LSHT und LEHT und war im LMIT nur geringgradig. In der vorliegenden Arbeit konnten die drei in vitro-Verfahren LSHT, LEHT und LMIT erfolgreich für Untersuchung der Effekte von Inhibitoren möglicher unspezifischer Anthelminthikaresistenz- Mechanismen bei gastrointestinalen Nematoden von Rindern angewendet werden. Weitere Studien unter Verwendung zusätzlicher resistenter Populationen sowie die Identifizierung und Charakterisierung von Pgps und CYPs, welche in AR beteiligt sind, sind erforderlich, um die Möglichkeiten der Verhinderung einer Entwicklung von Anthelminthika-Resistenzen zu verbessern.