Beeinflussung der Kontraktionskraft des Herzens über eine Proteinkinase C-abhängige Regulation der Proteinphosphatase 2A | Cardiac contractility is influenced by protein kinase C-dependent regulation of protein phosphatase 2A

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Frage, ob sich durch eine pharmakologische Aktivierung der PKC die Kontraktilität und das Kalzium- Handling von Kardiomyozyten durch eine Veränderung der B56α-regulierten PP2A- Aktivität beeinflussen lassen. Dazu wurde die PKC durch Applikation von Phenylephrin (PE) und Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) an Kardiomyozyten und linken Vorhöfen von B56α-überexprimierenden und Wildtyp-Mäusen aktiviert. Die optimale PE-Konzentration wurde mittels Konzentrations-Wirkungskurven ermittelt. Zur Differenzierung der Effekte von PE auf α- und β-Adrenozeptoren wurde zusätzlich Isoprenalin appliziert. Die durch pharmakologische Aktivierung der PKC mittels PE und PMA ausgelösten funktionellen Effekte wurden durch Messung der myozellulären Sarkomerlängen (SL) und Kalzium- Transienten sowie der Kontraktionskraft an linksatrialen Präparaten bestimmt. Die Gabe von PE führte in Wildtyp-Zellen, die die intrazelluläre Situation unter nativen physiologischen Bedingungen widerspiegeln, zu einem Anstieg der Peakamplitude und einer Verkürzung der Abfallzeit der Kalzium-Transienten. Die SL-Verkürzung änderte sich ebenso wie die Relaxationszeit dagegen nicht. Diese Ergebnisse lassen sich durch eine Abnahme der myofilamentären Kalzium- Sensitivität erklären. Die direkte Aktivierung der PKC durch Gabe von PMA bewirkte in An- oder Abwesenheit von PE einen Anstieg der SL-Verkürzung und von Δ[Ca]i in Wildtyp-Kardiomyozyten. Darüber hinaus war die Relaxationszeit und die Abfallzeit der Kalzium-Transienten verkürzt. Vergleichbare kontraktile Effekte einer Stimulation mit PMA und PE wurden in linken Vorhofpräparaten registriert. Die in transgenen Kardiomyozyten beobachteten parallelen Veränderungen von gesteigerter zellulärer Kontraktilität und Peakamplitude der Kalzium-Transienten nach pharmakologischer Stimulation der PKC könnten im Gegensatz zu den Wildtyp-Zellen ihre Ursache in der erhöhten basalen Kalzium- Sensitivität der Myofilamente haben. Die Zunahme der Kontraktilität und intrazellulären Peakamplitude der Kalzium-Transienten nach maximaler Aktivierung der PKC durch Gabe von PMA (± PE) war mit einer Abnahme der PP2AAktivität in Extrakten von isolierten Zellen oder atrialen Präparaten assoziiert. Dieser Effekt war unabhängig von entsprechenden Veränderungen der PP1-Aktivität. Im Gegensatz dazu waren PP2A- und PP1-Aktivität in transgenen Proben nach PMA-Gabe (± PE) unverändert. Die Abnahme der PP2A-Aktivität in Wildtyp-Herzen war allerdings nicht mit einer Veränderung des Gesamtphosphorylierungsgrades der regulatorischen Untereinheit B56α vergesellschaftet. Dieses könnte sowohl auf die Phosphorylierung einer anderen regulatorischen B56-Untereinheit als auch auf eine zellspezifische PKC- abhängige (d.h. nicht in Kardiomyozyten) Phosphorylierung von B56α hinweisen. Zusammengefasst wird deutlich, dass entsprechend der Arbeitshypothese der Beweis eines Zusammenhangs von PKC-Aktivierung, positiver Inotropie in Herzmuskelpräparaten und Abnahme der PP2A-Aktivität erbracht werden konnte. Die Verminderung der PP2A-Aktivität ist jedoch nicht Folge einer vermehrten Phosphorylierung von B56α unter den experimentellen Bedingungen dieser Arbeit.

The main objective of the present study was the examination of the influence of PKC activation on cardiac contractility and Ca2+ handling by modulating the B56α-regulated PP2A activity. For this purpose PKC was activated by the α-adrenoceptor agonist phenylephrine (PE) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in ventricular cardiomyocytes and left atria of B56α-overexpressing and wild-type mice. The functional effects of pharmacological PKC activation by PE and PMA were determined by measuring myocellular sarcomere lengths (SL) and Ca2+ transients as well as force of contraction on left atrial preparations. The application of PE to wild-type cells, reflecting native physiological conditions, resulted in an increase of the peak amplitude and a reduction of the decay time of Ca2+ transients. SL shortening and relaxation time were unchanged compared to controls. These findings might be explained by a decrease of the myofilament Ca2+ sensitivity. The direct activation of PKC by PMA caused an increase in SL shortening and Δ[Ca]i in wild-type cardiomyocytes, both in the presence or absence of PE. Furthermore, relaxation time and Ca2+ transient kinetics were shortened. We observed comparable contractile effects after stimulation with PMA and PE in left atria. In contrast to wild-type cells, transgenic cardiomyocytes exhibited parallel increases of myocellular contractility and peak amplitude of Ca2+ transients after PKC stimulation. These effects may result from a higher basal myofilament Ca2+ sensitivity in transgenic cardiomyocytes. The increase in SL shortening and Δ[Ca]i in wild-type cardiomyocytes, following maximum PKC activation by PMA (± PE), was associated with a decrease in PP2A activity in extracts of isolated cells or atrial preparations, whereas PP1 activity was not changed. In transgenic samples, PP2A and PP1 activities remained unchanged after PMA application (± PE). However, the reduction in PP2A activity in wild- type hearts was not accompanied by changes in the total phosphorylation status of the regulatory subunit B56α.This might result from either a phosphorylation of a different regulatory B56 subunit or other B56α-independent mechanisms. Taken together, according to the underlying working hypothesis this study provides evidence for a relationship between PKC activation, decreased PP2A activity and positive inotropy in myocardial preparations. However, the reduced PP2A activity is not a direct consequence of an increased B56α phosphorylation under experimental conditions of the present study.