Codon pair bias deoptimization of a major oncogene as an attenuation strategy for Marek’s disease herpesvirus | Codon-Paar-Deoptimierung eines Hauptonkogens als Strategie zur Attenuierung des Herpesvirus der Marekschen Krankheit

Degeneracy of the genetic code enables the encoding of most amino acids by more than one codon. Consequently, there is a vast number of ways in which a protein can be encoded. For example, a peptide with 300 amino acid residues can be encoded in 10^151 different ways. However, in actual coding sequences, the usage of synonymous codons is biased, that is some codons occur more often than their synonymous counterparts, a phenomenon called codon bias. Similarly, but independently of codon bias, occurrence of codon pair combinations in open reading frames (ORFs) is also biased. That is, certain codon pairs appear in coding sequences more often than it would be expected based on the overall frequencies of their constituent codons. This phenomenon, dubbed codon pair bias (CPB), has been found in all the species studied so far and has a greater impact on translational efficiency than codon bias. Virus attenuation by CPB deoptimization (CPBD) is achieved by reshuffling the existing synonymous codons in an ORF without changing the amino acid composition of the encoded protein. The reshuffling thus retains codon bias while simultaneously changing the CPB of the mutated genes. The mechanism behind CPBD mediated attenuation of viruses is currently explained by two competing, however poorly understood, theories: (i) CPBD increases the number of naturally underrepresented codon pair combinations, which results in inefficient translation leading to reduced protein production, and consequently virus attenuation. (ii) CPBD inadvertently increases the number of CpG and TpA dinucleotides in the sequence enabling the recoded viruses to be recognized by a yet to be identified innate immune mechanism. Despite the unclear underlying mechanism, CPBD based attenuation strategy has been successfully employed to attenuate several unrelated RNA viruses, e.g. poliovirus, influenza A virus, dengue virus, etc. The resultant attenuated virus is not only antigenically identical to the parental pathogenic virus but the sheer number of introduced mutations also makes it genetically extremely stable. Moreover, being a systematic method, it is seemingly applicable to several viruses. However, its suitability for attenuating large double-stranded DNA viruses like herpesviruses remained to be studied. Therefore, the present study dealt with the application of CPBD to attenuate a very virulent strain RB-1B of Marek’s disease virus (MDV), a highly contagious, lymphoproliferative and immunosuppressive herpesvirus that infects chickens. Due to its large size, CPBD of the entire MDV genome was impossible. Hence, meq, the major oncogene, was selected as a target gene. Despite being non-essential for viral growth in vitro, meq is a crucial immunogen as well as one of the few genes that are expressed during latency. CPB deoptimized meq showed lower protein production compared to the parental gene in vitro. A mutant virus, in which the parental meq was replaced with the CPB deoptimized version, showed comparable growth in cell culture, however, caused a slightly slower disease progression as well as decreased tumour incidence in vivo. These results indicate that although CPBD of the meq gene alone could not completely attenuate the virus, CPBD might be a suitable attenuation strategy for MDV.

Die sogenannte Degeneration des genetischen Codes ermöglicht die Verschlüsselung der meisten Aminosäuren durch mehr als nur ein Codon. Somit gibt es sehr viele Wege ein Protein zu codieren. Als Beispiel kann ein Peptid bestehend aus 300 Aminosäuren auf 10^151 verschiedene Arten codiert werden. Der Gebrauch von synonymen Codons bei der Proteincodierung ist jedoch nicht zufällig. Bestimmte Codons werden häufiger als ihre synonym gebrauchten Gegenstücke benutzt. Dieses Phänomen wird als Codon Bias bezeichnet. Unabhängig von dem Codon Bias ist auch das Vorhandensein der Codon-Paar-Kombinationen in den offenen Leserahmen (OLR; engl.: open reading frame, ORF) nicht zufällig. Das heißt, dass bestimmte Codon-Paar-Kombinationen häufiger vorkommen, als man basierend auf der Verwendungsfrequenz der einzelnen Codons, aus denen die Paare bestehen, annehmen würde. Dieses Codon-Paar-Bias (CPB) genannte Phänomen konnte bei allen bisher daraufhin untersuchten Arten nachgewiesen werden und hat einen größeren Einfluss auf die Effizienz der Translation als das Codon Bias. Virus-Attenuierung durch CPB-Deoptimierung (CPBD) kann erreicht werden, indem die vorhandenen synonymen Codons in einem OLR neu angeordnet werden, ohne dabei die bestehende Aminosäurenkomposition zu verändern. Die Umstrukturierung verändert das CPB, während das Codon-Bias unverändert bleibt. Es gibt zurzeit zwei konkurrierende, jedoch noch wenig erforschte Theorien, die versuchen den Mechanismus zu erklären, welcher bei der CPBD zur Virus-Attenuierung führt: (i) CPBD erhöht die Zahl der Codon- Paar-Kombination, die naturgemäß vermieden werden, was eine ineffizientere Translation und somit eine verringerte Proteinproduktion zur Folge hat. So führt die CPBD zur Attenuierung des Virus. (ii) CPBD erhöht unbeabsichtigterweise die Anzahl der CpG und TpA Dinucleotide in der deoptimierten Sequenz, wodurch das umcodierte Virus von einem noch nicht identifizierten Mechanismus des angeborenen Immunsystem erkannt wird. Trotz fehlender Einsicht in den Mechanismus sind bereits verschiedene, nicht verwandte RNA-Viren wie z.B. Poliovirus, Influenza-A-Virus und Denguevirus erfolgreich mit der an CPBD angelehnten Strategie abgeschwächt worden. Die resultierenden, attenuierten Viren sind nicht nur antigenisch identisch mit dem Wildtyp-Virus, sondern durch die Vielzahl der eingefügten Punktmutationen auch genetisch äußerst stabil. Als systematische Methode kann die CPBD vermutlich auf eine Vielzahl von Viren angewendet werden. Ob diese Strategie auch zur Abschwächung großer doppelsträngiger-DNA-Viren angewendet werden kann, wurde bisher noch nicht untersucht. Aus diesem Grund beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit der Verwendung der CPBD zur Attenuierung eines sehr virulenten Stamms, nämlich des RB-1B-Stamms, des Virus der Marekschen Krankheit (MDV). MDV ist ein hochansteckendes, lymphoproliferatives, immunsuppressives Herpesvirus, welches Hühner infiziert. Die CPBD des gesamten Genoms war bedingt durch seine Größe unmöglich. Deswegen wurde in dieser Arbeit meq, das Hauptonkogen von MDV, zum Gegenstand der Untersuchung gemacht. Obwohl meq nicht essentiell für das in vitro Wachstum des Virus ist, ist es ein wichtiges Immunogen und gehört zu den wenigen Genen, die während der Latenz exprimiert werden. Die CPBD von meq hatte im Vergleich zum Wildtyp-Gen eine geringere Proteinproduktion in vitro zur Folge. Eine Virusmutante, bei der meq durch eine CPB-deoptimierte Variante des Gens ersetzt wurde, zeigte ein mit dem Wildtyp vergleichbares Wachstum in Zellkultur. Dennoch verursachte die Virusmutante einen leicht verlangsamten Krankheitsverlauf sowie eine herabgesetzte Tumorinzidenz in vivo. Obwohl die CPBD von meq allein nicht zu einer vollständigen Attenuierung des Virus führte, deuten die erlangten Ergebnisse darauf hin, dass die CPBD eine geeignete Methode zur Attenuierung von MDV sein kann.