Antiestrogene und Endometriumkarzinome | Effekte von Antiestrogenen auf Tumorwachstum und Expression von Estrogen-, Progesteron- und epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren | Antiestrogens and Endometrial Adenocarcinoma | Antiestrogenic effects on tumor growth and on protein expression of estrogen-, progesterone- and epidermal growth factor receptors ý in vitro and in vivo

Titelblatt, Inhalts- und Abkürzungsverzeichnis, Danksagung, Lebenslauf A Einleitung B Literatur C Material und Methoden D1 Ergebnisse Teil 1 D2 Ergebnisse Teil 2 E Diskussion F Zusammenfassung F1 Summary Literaturverzeichnis

Das Endometriumkarzinom ist die häufigste, maligne Erkrankung des Genitaltraktes der Frau. In den meisten Stadien wird das Endometriumkarzinom operativ durch Hysterektomie entfernt. Eine adjuvante oder auch palliative Endokrintherapie mit Antiestrogenen (AE), wie sie beim hormonsensitiven Mammakarzinom routinemäßig angewendet wird, ist beim Endometriumkarzinom nicht etabliert. Zur Behandlung inoperabler Endometriumkarzinome und alternativ zur Operation sollte mit den Untersuchungen zu der vorliegenden Arbeit der Erfolg einer AE-Therapie am Endometriumkarzinom evaluiert werden. Die Untersuchungen erfolgten an sechs humanen, endometrialen Adenokarzinomzellinien, die aufgrund proteinbiochemischer Bestimmung (Enzymimmunoassay) der Estrogenrezeptor (ER)-Expression in ER-negative und ER- positive Zellinien eingeteilt wurden. Von den ER-positiven Zellinien exprimierte ECC-1 187 fmol ER/mg Protein und Ishikawa 24 fmol ER/mg Protein. Bei den ER-negativen Zellinien handelte es sich um die Zellinien MFE-296, MFE-280, MFE-319 und KLE. Die Untersuchungen erfolgten vergleichend mit den nichtsteroidalen, partialagonistischen AE Tamoxifen und Raloxifen sowie mit den steroidalen, reinen AE ZK 191703 und ICI 182,780. Es wurden in vitro-Proliferationsassays mit Kristallviolettmessung und in vivo-Untersuchungen in estrogen- oder tamoxifensubstituierten SCID Mäusen bei subkutaner Tumortransplantation durchgeführt. Ausschließlich bei ER-positiven Zellinien wurde eine Estrogen- oder AE-Sensitivität beobachtet. In ECC-1-Zellen war die Wachstumsstimulierung durch Estradiol und die Wachstumsinhibition durch AE in vitro und in vivo stärker als in Ishikawazellen. Diese Beobachtungen zeigen eine Korrelation zwischen ER-Menge und Estrogen- bzw. Antiestrogenwirkung. Das reine AE ZK 191703 war in seiner antiproliferativen Wirkung potenter als die anderen AE. In vitro betrug die IC50 von ZK191703 in ECC-1-Zellen 6,6 x 10-10 M verglichen mit 1,4 x 10-9 M, der IC50 von ICI 182,780. In vivo bewirkte das oral applizierte ZK 191703 im Vergleich zu den oral applizierten AE Tamoxifen und Raloxifen und im Vergleich zu dem subkutan einmal monatlich applizierten ICI 182,780 in beiden ER- positiven Zellinien gegenüber den estrogen- und tamoxifenstimulierten Kontrolltumoren eine signifikante Tumorwachstumshemmung. Das partialagonistische AE Tamoxifen stimulierte in Ishikawatumoren das Wachstum und inhibierte es in ECC-1-Tumoren, so daß auf eine tumorspezifisch unterschiedliche Wirkung von Tamoxifen in endometrialen Adenokarzinomen geschlossen wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-gefärbten Schnitte der ER-positiven, estrogenstimulierten Tumore der in vivo-Versuche zeigten eine Verschiebung des Tumorgewebe/Stroma-Verhältnisses (TSV) in Richtung Tumorgewebe. Im Gegensatz dazu zeigten die HE-gefärbten Schnitte der ER-negativen endometrialen Tumore eine Verschiebung des TSV in Richtung Stroma, wenn sie mit Estrogenen stimuliert wurden. Diese Beobachtungen in den ER-negativen Tumoren deuten auf eine Estrogensensitivität des murinen Stromas hin bei estrogenunbeeinflußtem Tumorwachstum. In beiden Tumorgeweben zeigte das TSV eine Verschiebung in die jeweils andere Richtung nach Behandlung mit AE, welche die estrogenen Effekte antagonisierten. Die selektive ER-Destabilisierung in humanen Endometriumkarzinomen durch Behandlung mit den reinen AE ZK 191703 und ICI 182,780 wurde in vitro und in vivo mit zwei Methoden nachgewiesen: proteinbiochemisch und immunhistochemisch mit dem monoklonalen Antikörper 1D5. Diese ER-Destabilisierung war konzentrationsabhängig, in vitro bereits nach 24 Stunden zu beobachten und nach 5-7 Tagen in gleicher Weise nachweisbar. Die hohe ER-Expression nach langer Inkubationszeit mit niedriger ICI 182,780-Dosierung deutet auf ein konzentrationsabhängiges, zeitlich verzögertes escape-Phänomen hin. Die Hemmung ER-induzierter Effekte durch reine AE wurde weiterhin durch eine konzentrationsabhängige Abnahme der Progesteronrezeptor (PgR)-Expression nach Behandlung mit reinen AE in vitro und in vivo in beiden ER-positiven Zellinien proteinbiochemisch gezeigt. Eine Korrelation zwischen Expression von ER und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor wurde in den Zellinien Ishikawa und ECC-1 proteinbiochemisch nicht beobachtet. Die in Zellzyklusanalysen am Durchflußzytometer beobachtete, auf 85-90% erhöhte ECC-1-Zellfraktion in der G0/G1-Phase nach Inkubation mit reinen AE weist auf eine Arretierung der Zellen in dieser Phase hin. Diese präklinischen Arbeiten zeigten einen therapeutischen Effekt von reinen AE auf estrogen- und tamoxifenstimulierte Endometriumkarzinome. Aufgrund der Ergebnisse könnte ZK 191703 in der adjuvanten, aber auch palliativen Endokrintherapie gegenüber ICI 182,780 erfolgsversprechender sein. Patientinnen mit präexistentem Endometriumkarzinom nach Tamoxifen- Langzeittherapie, vor der Menopause mit endogener Estrogenaktivität und nach der Menopause unter Estrogen-Ersatztherapie sind Zielgruppe dieser AE- Therapie. Voraussetzung für eine AE-Therapie ist jedoch die Estrogensensitivität des Endometriumkarzinoms. Die Bestimmung des ER-Status vor Therapiebeginn ermöglicht eine Aussage über die Ansprechrate des Tumors auf das AE und eine prognostische Bewertung der Therapie hinsichtlich der zu erwartetenden Tumorregression. Das reine, steroidale AE ZK 191703 sollte in kli-nischen Studien auf seine Wirksamkeit gegenüber endometrialen Adenokarzinomen hin geprüft werden.

Endometrial carcinoma is the most common malignancy of the female genital tract. Although hysterectomia is the conventional therapy of endometrial carcinoma at present, pure antiestrogens (AE) could be useful in support or even as an alternative for the treatment. Adjuvant or palliative therapies as with AE in breast cancer, have not yet been established for endometrial cancer. The aim of this study was to establish a preclinical rationale for use of AE in the treatment of endometrial carcinoma. Six human endometrial adenocarcinoma cell lines were analyzed for their estrogen receptor (ER) expression by an ER enzyme immunoassay. Based on these results the human endometrial carcinoma cell lines were defined as ER-positive and ER-negative cell lines. The ER-expression of ECC-1 cells was 187 fmol ER/mg protein whereas Ishikawa cells expressed 24 fmol ER/mg protein. In the human endometrial cancer cell lines MFE-296, MFE-280, MFE-319 and KLE ER protein expression was not detectable. These cell lines were further used to compare the growth inhibitory potency of nonsteroidal partialagonistic AE tamoxifen and raloxifen with steroidal pure AE ZK 191703 and ICI 182,780. The crystal violet method was used for in vitro proliferation assays. For in vivo studies the human endometrial cancer cell lines were implanted subcutaneously in estrogen- or tamoxifen-substituted immune-deficient SCID mice. Estrogens or AE displayed effects on cell proliferation only in ER- positive cell lines. In vitro and in vivo growth stimulation by estrogens and growth inhibiton by AE were more potent in ECC-1 cells than in Ishikawa cells. We found a positive correlation between ER expression and estrogenic and antiestrogenic effects. The pure AE ZK 191703 was the most potent AE in vitro with a IC50 in ECC-1 cells of 6,6 x 10ý10 M compared to the IC50 of ICI 182,780 with 1,4 x 10ý9 M. The inhibition of endometrial tumor growth in vivo by treatment with ZK 191703 was significantly different in comparison to the estrogen-and tamoxifen-stimulated control group. In these experiments ZK 191703, tamoxifen and raloxifen were administered orally whereas ICI 182,780 was given subcutaneously once a month. Tamoxifen stimulated the tumor growth of Ishikawa cells but inhibited the growth of ECC-1 cells. Therefore, we concluded a tumor-specific effect of tamoxifen in human endometrial adenocarcinoma. Hematoxylin-Eosin(HE)-stained tumor sections of ER-positive estrogen- stimulated endometrial tumors showed a shift in tumor tissue/stromal proportion (TSP) in favor of the tumor tissue. In contrast HE-stained tumor sections from ER-negative endometrial tumors showed a shift in TSP in favor of the stromal tissue, when stimulated with estrogens. These results indicated an estrogen-stimulated growth of murine stromal cells as tumor growth of ER- negative endometrial carcinoma cells was estrogen-unaffected. After treatment with AE, which antagonize the estrogen effects, the TSP of ER-positive and ER- negative tumors shifted the other direction. The ER destabilisation in human endometrial carcinomas by treatment with pure AE ZK 191703 and ICI 182,780 was demonstrated in vitro and in vivo by two independent meth-ods: ER enzyme immunoassay and immunohistochemistry using the monoclonal antibody 1D5. ER destabilisation was dose-dependent as observed after 24 hours and persisted 5-7 days. The increased ER expression after low- dose longtime-treatment with ICI 182,780 is probably due to a delayed escape phenomenon. In addition, the inhibition of an ER response by pure AE was shown in vitro and in vivo by a dose-dependent decrease in progesterone receptor (PgR) expression after incubation with pure AE. A correlation between ER and epidermal growth factor receptors expression was not observed in Ishikawa cells or ECC-1 cells on protein level. Cell cycle analyses showed an 85-90% increase in ECC-1 cell fraction of G0/G1-phase after incubation with pure AE. Therefore, we concluded an arrest of human endometrial ER-positive adenocarcinoma cells in G0/G1-phase of cell cycle. The results obtained from our preclinical studies showed a therapeutic effect of pure AE against estrogen- and tamoxifen-stimulated human endometrial carcinoma. From these data we conclude that the pure AE ZK 191703 could be more potent than ICI 182,780 in adjuvant and palliative endocrine therapies. Target groups of endocrine AE-therapy are patients with preexisting endometrial carcinoma under tamoxifen-longtime therapy, premenopausal patients with endogenous estrogen-activity and postmenopausal patients with estrogen- replacement therapy. ER sensitivity of the endometrial tumors to estrogens is a prerequisite for this therapy. The determination of ER expression in endometrial tumors allows a statement of tumor responsiveness to AE-treatment and an assessment of prognosis with regard to tumor regression. Our findings regarding ZK 191703 require further evaluation of this pure steroidal AE in clinical studies in order to determine its antiproliferative effectiveness against human endometrial adenocarcinoma.