Molekulare Klonierung und Charakterisierung von Serpinen: potentielle Immunmodulatoren | Molecular cloning and characterization of serpins as potential immunomodulators

Titelblatt 1 Titelblatt 2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Zusammenfassung Summary Einleitung Ziele der Arbeit Ergebnisse Diskussion Schlußfolgerung Methoden Material Literatur Vorträge und Poster Anhang Danksagung Lebenslauf Selbständigkeitserklärung

Filarien sind permanent einer Vielzahl von Immuneffektormechanismen ihres Wirtes ausgesetzt. Ihr Überleben hängt davon ab, schädlichen Immunantworten auszuweichen oder sie zu modulieren. Eine Strategie, um dies zu erreichen, ist die Freisetzung immunmodulatorischer Komponenten, die die Effektormechanismen blockieren. Zu diesen sekretierten Molekülen gehören Serpine, für die Immunevasionsfunktionen beschrieben worden sind (Zang et al. 1999, 2000, Maizels et al. 2001). In dieser Arbeit wollte ich die immunmodulatorische Kapazität eines Serpins der Nagetierfilarie Acanthocheilonema viteae im Vergleich zu einem homologen Protein des frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans analysieren. Das Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob Serpine von A. viteae vom Parasiten speziell genutzt werden, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen oder ob Serpine des frei lebenden Nematoden C. elegans ähnliche immunmodulatorische Aktivitäten besitzen. Ein A. viteae- und ein C. elegans-Serpin wurden kloniert, exprimiert und charakterisiert hinsichtlich ihrer inhibitorischen und immunmodulatorischen Eigenschaften. Das rCe-Serpin zeigte in vitro bei den verwendeten Serinproteasen eine Spezifität für Trypsin und Cathepsin G. Die Proliferation sowohl polyklonal als auch Antigen-spezifisch stimulierter Mausmilzzellen wurde durch das rCe-Serpin inhibiert und die Bildung von IL-10 verstärkt. Die Hemmung des mitogen wirkenden Cathepsin G und die Induktion der IL-10-Produktion sind wichtige Faktoren für die zelluläre Hyporeaktivität. Das rAv-Serpin zeigte weder eine inhibitorische Wirkung auf die eingesetzten Proteasen noch auf die T-Zell-Proliferation. Da das Serpin des frei lebenden C. elegans über immunmodulatorische Fähigkeiten verfügt, sind Serpine vermutlich nicht durch die parasitisch lebenden Nematoden zur Beeinflussung der Wirtsabwehr spezifisch modifiziert worden, sondern stellten für die Nematoden einen Vorteil beim Übergang zur parasitären Lebensform dar. Das ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit klonierte und exprimierte Serpin des parasitären Protozoen E. tenella hemmte die Serinproteasen Trypsin, Chymotrypsin, porzine Pankreaselastase und Cathepsin G. Es verminderte die Proliferation polyklonal stimulierter Mausmilzzellen und bewirkte eine tendenziell erhöhte IL-10-Bildung. Antigen-spezifisch stimulierte Mausmilzzellen wurden durch rEt-Serpin nicht in ihrer Proliferation gehemmt.

Filarial parasites are constantly exposed to an array of immune effector mechanisms of their hosts. Their survival therefore depends on the evasion or modulation of harmful immune responses. One strategy to cope with the host s immune responses is the release of immunomodulators that block effector mechanisms. Serpins (serine protease inhibitors) are secretory molecules that have been described to have functions in immune evasion (Zang et al. 1999, 2000, Maizels et al. 2001). To determine parasite-specific properties of serpins, the immunomodulatory capacity of a serpin of the rodent filarial nematode Acanthocheilonema viteae was analysed in comparison to a homologous protein of the free-living nematode Caenorhabditis elegans. The aim of the project was to investigate whether serpins of A. viteae are specifically used by the parasite to evade immune responses of the host or whether serpins of the free-living nematode C. elegans have similar immunomodulatory activities. Homologous serpins from A. viteae and C. elegans were cloned, expressed as proteins in E. coli, and their inhibitory and immunomodulatory properties were characterised. The serine proteases from C. elegans (rCe-Serpin) showed trypsin and cathepsin G specificity. In addition, it inhibited the proliferation of polyclonally as well as antigen-stimulated spleen cells of mice, and enhanced the production of IL-10. The inhibition of the mitogenic cathepsin G and the induction of the IL-10 production are important factors in cellular hyporesponsiveness. On the other hand, the serine protease from A. viteae (rAv-Serpin) showed no inhibitory property on the same proteases or T cell proliferation. Since the serpin of the free-living C. elegans posseses immunomodulatory properties, serpins have probably not been specifically modified by parasitic nematodes for influencing the host s immune response. It may therefore be surmised that serpins are a preadaption to a parasitic life style of nematodes. To further verify whether serpins of parasites have specific properties, a serpin of the parasitic protozoon E. tenella (rEt- Serpin) was also cloned and expressed. It inhibited the serine proteases trypsin, chymotrypsin, porcine pancreatic elastase and cathepsin G. The rEt- Serpin inhibited the proliferation of polyclonal stimulated spleen cells of mice and showed a tendency to enhance the IL-10 production. However, proliferation of antigen specific stimulated spleen cells was not inhibited by rEt-Serpin.