Zoonosis alimentarias en el cerdo ibérico: prevalencia y control desde la granja para la obtención de alimentos seguros | Food-borne zoonosis in the iberian pig: prevalence and control from farm for obtaining safe food

Esta tesis doctoral se presenta como compendio de publicaciones de los trabajos derivados del proyecto “SAFEPORK Zoonosis Alimentarias en el cerdo Ibérico: prevalencia y control para la obtención de alimentos seguros”, financiado con el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, y gestionado por la Agencia de Innovación y Desarrollo de Andalucía (IDEA) (referencia #351504). El cerdo Ibérico finaliza su periodo de engorde principalmente en la dehesa, ecosistema que aporta grandes mejoras en lo que se refiere al bienestar de los animales, pero que por otro lado favorece la interacción con otras especies animales, tanto domésticas como silvestres, lo que hace que las medidas de bioseguridad sean de más difícil adopción en las explotaciones de cerdo Ibérico, aumentando la susceptibilidad frente a determinados patógenos zoonósicos. Entre los principales agentes zoonósicos alimentarios descritos por la EFSA destacan Campylobacter spp., Salmonella spp. y Listeria monocytogenes. La importancia de estos zoonósicos alimentarios tanto desde el punto de vista de la salud pública como desde el punto de vista comercial, a la hora de abrir fronteras comerciales, hace necesario la consideración de este problema de manera global en las distintas áreas de producción del cerdo Ibérico con el fin de determinar el flujo de dichos agentes e implantar medidas para reducir su incidencia y por tanto garantizar la obtención de productos que no pongan en riesgo la salud del consumidor. El primer objetivo de esta tesis doctoral ha sido determinar la prevalencia de los distintos patógenos zoonósicos que afectan al cerdo Ibérico en la dehesa mediante estudio de los animales sacrificados en matadero. Para ello se ha desarrollado el trabajo (Morales- Partera et al., 2018, Food Control, 92, 208-215) que evaluó la prevalencia y diversidad de Salmonella spp., Campylobacter spp. y Listeria monocytogenes a lo largo de la cadena de producción del cerdo Ibérico en matadero. Para ello se recolectaron un total de 750 muestras (5 muestras / animal; 15 animales / granja; 5 granjas / matadero) de dos mataderos y se analizaron mediante metodologías ISO específicas los distintos patógenos. Salmonella spp. (12,93%; IC95 10,72-15.52%), Campylobacter spp. (17,17%, IC95 13,00-21,74%) y L. monocytogenes (9,07%; IC95 7,21-11,33%) fueron identificados en diferentes fases de la cadena de producción, con la prevalencia más alta detectada en las tonsilas para Salmonella spp. (30,67%; IC95 23,85-38,44%) y L. monocytogenes (39,33%, IC95 31,87-47,32%) y en heces para Campylobacter spp. (57,33%; IC95 49,33- 64,96%). Se detectaron trece serotipos diferentes de Salmonella, siendo la Salmonella Typhimurium monofásica la más frecuente. C. coli, C. jejuni y L. monocytogenes, serotipos 4b y 1 / 2a, también fueron identificados. En cuanto a la prevalencia total de Salmonella spp. en muestras de piel fue significativamente mayor en el matadero B que en el A. Además, se observó una prevalencia más alta, aunque no significativa, de los patógenos seleccionados en muestras de carne del matadero B con respecto al matadero A (10,67% vs 0% para Campylobacter spp.; y 4% vs 0% para Salmonella spp. y L. monocytogenes). Nuestros resultados resaltan el riesgo de contaminación de la carne de cerdo por los microorganismos en estudio y señalan la importancia de implementar medidas de control específicas. El segundo objetivo ha consistido en aplicar medidas correctoras que permitan disminuir la prevalencia de los distintos agentes zoonósicos alimentarios de interés. Para esto se ha llevado a cabo el trabajo (Morales-Partera et al., 2019, actualmente en revisión). Este estudio evaluó el efecto de Pediococcus acidilactici como alternativa a los antibióticos y su impacto en los parámetros productivos y la microbiota fecal de cerdos en fase de engorde. Un total de 57 cerdos se seleccionaron al azar y se distribuyeron por peso en dos grupos: (1) grupo control, con un peso corporal inicial de 143,28 ± 14,26 kg que recibió una dieta control; y (2) grupo tratado, con un peso corporal inicial de 146,41 ± 13,71 kg que recibió la dieta de control suplementada con Pediococcus acidilactici durante los últimos 31 días de la etapa final antes de su llegada a matadero. En los días 0, 22 y 31 desde el inicio del estudio, se registraron el peso y la ganancia media diaria (ADG). A los 0 y 31 días se recogieron muestras fecales individuales de 8 cerdos por grupo para el recuento de enterobacterias, Escherichia coli, Campylobacter spp., bacterias del ácido láctico y detección de Salmonella spp. Se observó una reducción significativa en el recuento de Campylobacter spp. en animales tratados (P = 0.004) en comparación con el grupo de control. Este estudio indica que la suplementación con Pediococcus acidilactici representa una aproximación útil para controlar la carga de Campylobacter spp.en el tracto intestinal en cerdos criados en extensivo antes de su llegada a matadero. El tercer y último objetivo de esta tesis doctoral ha sido determinar la viabilidad de los patógenos seleccionados frente a las condiciones de curación empleadas en los productos del cerdo Ibérico. Para ello se llevó a cabo el trabajo (Morales-Partera et al., 2017, Int J Food Microbiol, 258, 68-72), en el que se analiza la eficacia del proceso de curación de los lomos de cerdos Ibéricos criados en extensivo en la reducción de tres de los patógenos más importantes transmitidos por los alimentos. Un total de 28 segmentos de lomo de cerdo, con un peso promedio de 0,57 ± 0,12 kg, se dividieron en cuatro grupos, tres de ellos inoculados por inmersión con 7 log CFU / ml de Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli o Listeria innocua y el último se inoculó por inmersión con medio estéril (grupo control). Los lomos se trataron con una mezcla de aditivos y especias propios del curado, se embutieron y se curaron durante 64 días. Se evaluó el análisis microbiológico, el pH y la actividad del agua (aw) en cuatro etapas. Como se esperaba, los valores de pH y aw disminuyeron con el tiempo de curado. S. Typhimurium y C. coli disminuyeron significativamente (3,28 y 2,14 unidades logarítmicas, respectivamente), pero se observó una reducción limitada de L. innocua (0,84 unidad logarítmica) a lo largo del proceso de curado. En nuestro estudio, tres factores se consideraron críticos para la viabilidad de los patógenos estudiados a lo largo del proceso de curación: (i) la concentración inicial de las bacterias, (ii) la reducción progresiva del pH y (iii) la reducción de los valores de aw. Nuestros resultados animan al incremento de la presión de muestreo en diferentes etapas del proceso de producción de la caña de lomo para garantizar la ausencia de los tres patógenos.

This PhD is presented as a compendium of publications from the research Project “SAFEPORK Food Zoonoses in the Iberian pig: prevalence and control to obtan safe food”, financed with the European Regional Development Fund, and managed by the Agency for Innovation and Development of Andalusia (IDEA) (reference #351504). The Iberian pig finishes its fattening period mainly in the Dehesa, an ecosystem that provides great improvements in terms of animal welfare, but on the other hand favors the interaction with other animal species, both domestic and wild, which makes that biosecurity measures are more difficult to be adopted in Iberian pig farms, increasing susceptibility to certain zoonotic pathogens. Among the main food zoonotic agents described by EFSA we can find Campylobacter spp., Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. The importance of these food-borne zoonotic pathogens both from the public health and from the commercial points of view, when opening commercial borders, makes it necessary to consider this problem globally in the different areas of production of the Iberian pig in order to determine the circulation of these agents and implement measures to reduce their incidence and therefore ensure the procurement of products that do not endanger the health of the consumer. The first aim of this PhD thesis was to determine the prevalence of the different zoonotic pathogens that affect the Iberian pig in the dehesa by studying slaughtered animals (Morales-Partera et al., 2018, Food Control, 92, 208-215). To evaluate the prevalence and diversity of these microorganisms along the free-range pork production chain, a total of 750 samples (5 samples/animal; 15 animals/farm; 5 farms/slaughterhouse) were collected from two slaughterhouses and analysed by specific ISO methodologies. Salmonella spp. (12.93%, CI95 10.72-15.52%), Campylobacter spp. (17.17%, CI95 13.00-21.74%) and L. monocytogenes (9.07%, CI95 7.21-11.33%) were recovered at different stages of the production chain, with the highest prevalence detected in tonsils for Salmonella spp. (30.67%, CI95 23.85-38.44%) and L. monocytogenes (39.33%, CI95 31.87-47.32%) and in faeces for Campylobacter spp. (57.33%, CI95 49.33-64.96%). Thirteen different Salmonella serotypes were detected with monophasic Salmonella Typhimurium as the most frequent one. C. coli, C. jejuni and L. monocytogenes serotype 4b and 1/2a were also identified. A significant higher prevalence of Salmonella spp. in total and from skin samples in slaughterhouse B than in slaughterhouse A was detected. In addition, a higher, although not significant, prevalence of the selected pathogens was observed in meat samples from slaughterhouse B with respect to slaughterhouse A (10.67% vs 0% for Campylobacter spp.; and 4% vs 0% for Salmonella spp. and L. monocytogenes). Our results highlight the risk of contamination of pork meat by the microorganisms under study and point out the importance of implementing specific control measures. The second aim of this PhD thesis was to apply corrective measures to reduce the prevalence of zoonotic agents detected along the production chain (Morales-Partera et al., 2019, under review). This study evaluated the effect of Pediococcus acidilactici as alternative to antibiotics and its impact on performance parameters and faecal microbiota of finishing pigs. A total of 57 free-range pigs were randomly allocated and blocked by weight into two groups: (1) control group, with an initial BW of 143.28±14.26 kg which received a control diet; and (2) treated group, with an initial BW of 146.41±13.71 kg which received the control diet supplemented with Pediococcus acidilactici during the last 31 days of the finishing stage prior to their delivery to the slaughterhouse. At days 0, 22 and 31 from the beginning of the study weight and average daily gain (ADG) were recorded. Individual faecal samples from 8 pigs per group at 0 and 31 days were analysed for enumeration of Enterobacteria, Escherichia coli, Campylobacter spp., lactic acid bacteria and detection of Salmonella spp. A significant decrease in the counts of Campylobacter spp. in treated animals (P=0.004) in comparison with the control group was detected. This study indicates that supplementation with Pediococcus acidilactici may represent a useful approach to control Campylobacter spp. load in the intestinal tract of free-range finishing pigs prior to slaughter. The third objective of this PhD thesis was to determine the viability of selected pathogens against dry-curing conditions used in Iberian pig products (Morales-Partera et al., 2017, Int J Food Microbiol, 258, 68-72). In this study, the efficacy of the dry curing process of pork loins obtained from free-range pigs in the reduction of three of the most important foodborne pathogens is analysed. A total of 28 pork loin segments, with an average weight of 0.57 ± 0.12 kg, were divided into four groups with three being inoculated by immersion with 7 log CFU/ml of either Salmonella Typhimurium, Campylobacter coli or Listeria innocua and the last one inoculated by immersion with sterile medium (control group). The loin segments were treated with a seasoning mixture of curing agents and spices, packed in a synthetic sausage casing and cured for 64 days. Microbiological analysis, pH and water activity (aw) were assessed at four stages. The values of pH and aw decreased with curing time as expected. S. Typhimurium and C. coli dropped significantly (3.28 and 2.14 log units, respectively), but limited reduction of L. innocua (0.84 log unit) was observed along the curing process. In our study, three factors were considered critical: the initial concentration of the bacteria, the progressive reduction of pH and the reduction of aw values. Our results encourage performing periodic análisis at different stages of the manufacturing of dry-cured pork loins to ensure the absence of the three evaluated foodborne pathogens.