Improvement of vinegar processing through integrated study of the microbiome and metabolome | Mejora de la elaboración de vinagre a través del estudio integrado del microbioma y metaboloma

Introduction and Thesis motivation: The industrial elaboration of vinegar is performed from an alcoholic medium in which a mixed culture of acetic acid bacteria (AAB) is used to carry out a biotransformation process of ethanol into acetic acid. Although the acetification process is well known from a practical and technical point of view, there are still may fundamental aspects that have not been exhaustively studied, especially, those that ultimately control the activity and behavior of the complex microbiota responsible for the process. It is known that these microbial communities are mostly composed of a few species of AAB, strict aerobes and the main responsible for the aforementioned process (Gullo et al., 2014; Peters et al., 2017). However, minor fractions of both AAB and other microorganisms may coexist in the medium with the predominant species and contribute to the community function (Trček et al., 2016; Peng et al., 2021). Members of these microbiota and, especially AAB, because of their particular growing conditions based mainly on the requirement for a liquid medium rich in ethanol as a carbon source, homogeneous, and with constant dissolved oxygen supply, are difficult to isolate and cultivate outside these environments where they are normally developed (Mamlouk and Gullo, 2013; Gullo et al., 2014). In this context, the identification, as well as biodiversity and behavior studies of these microorganisms at a molecular level present several difficulties. These aspects not only imply a challenge to improve the understanding of scientific-basic concepts of these bacteria but hinder to control of the final quality of the obtained products, since it depends on the microbial composition, the raw material, and the operating conditions (Mas et al., 2014). In this context, omics sciences currently offer multiple possibilities for the identification and characterization of microbial communities in their natural environment, without the need for isolation. In the field of vinegar production, existing studies are mainly focused on metagenomics and metabolomics of traditional vinegars, both those obtained through solid-state and surface fermentation, as well as molecular studies of concrete species (Xia et al., 2016; Peters et al., 2017; Wu et al., 2017; Zhu et al., 2018; Wang et al., 2021). This work, focused on the use of submerged culture as the production method and diverse omics tools, aims to contribute to expanding current knowledge in this research area. Content of the Thesis: In the present Doctoral Thesis, the development of three acetification profiles was characterized and compared to study the evolution of system variables and the effect of the three raw materials used: a synthetic alcohol-based medium, a fine wine, and a craft beer, on the composition and activity of the microbiota responsible for the process. With this objective, different omics tools based on metaproteomics (LC-MS/MS), metagenomics (16S rRNA sequencing), protein fingerprinting (MALDI-TOF MS), and metabolomics (SBSE couple with GC-MS) were used, as well as submerged culture, working in a semi-continuous mode, for vinegar production at a pilot scale, trying to mimic industrial procedures. First, the characterization of the acetification profiles of working raw materials, from a metaproteomic approach, allowed the description of the composition and behavior of the microbiota responsible for the process. The Komagataeibacter genus, represented mostly by the species Komagataeibacter europaeus and followed by other related species, conformed to the predominant microbiota. Additionally, this analysis revealed a minor fraction of microorganisms composed of typical genera of the Acetobacteraceae family, never described in vinegar to date. Subsequent metagenomics and protein fingerprinting studies confirmed the predominance of the Komagataeibacter genus and allowed the description of new bacterial genera in these media and even archaea groups. From the metaproteomics studies, quantitative analyses focused on the protein profile of the main species, K. europaeus, allowed for differentiating among the main biological processes that occur throughout the acetification cycle according to the variations in the activity of associated proteins. The results from the characterization and comparison of two acetification profiles of natural raw materials: fine wine and craft beer, allowed us to suggest a molecular strategy in which K. europaeus may ensure its survival through the use of nutrients present in each substrate. Based on this, the metabolization of acetic acid, from incomplete oxidation of ethanol, through the TCA cycle and other metabolic related pathways (pentose phosphate pathway and glycolysis), supplying biosynthetic precursors (amino acids and nucleic acids), as well as membrane mechanisms for acetic acid release, may be processes of biotechnological interest for the submerged vinegar production. Finally, a preliminary study at a metabolomic level led to the characterization of the “volatilome” and differentiation of key minor volatiles of both the raw materials and their respective acetifications, allowing to establish significant differences, these being more evident between the synthetic and natural media. Conclusión: The research conducted in this work has allowed for characterizing and confirming the composition of the microbiota present throughout three acetification profiles, with K. europaeus as predominant species followed by a less-abundant microorganisms fraction including closely related species, species from other typical AAB genera, groups of bacteria, other than AAB, and even archaea. From a quantitative point of view, it has been demonstrated that the use of diverse raw materials does not directly influence the composition of the microbiota, mostly common, but it influences the activity, behavior, and molecular strategies used throughout the acetification. These findings may contribute to improving the existing current knowledge on the composition and role of the microbial communities responsible for the acetification, as well as expanding the use of new raw materials for the elaboration of vinegar through submerged culture. In turn, these achievements might lead to the improvement of the operating conditions for the obtention of new types of vinegar with improved organoleptic properties and quality.

Introducción y motivación de la Tesis: La elaboración de vinagre de forma industrial se realiza a partir de un medio de origen alcohólico en el que interviene un cultivo mixto de bacterias acéticas (BAA) para llevar a cabo un proceso de biotransformación del etanol en ácido acético. A pesar de que el proceso de acetificación es bien conocido desde un punto de vista práctico y técnico, existen todavía numerosos aspectos fundamentales que no se han estudiado de forma exhaustiva, especialmente, aquellos que controlan, en último término, la actividad y el comportamiento de las complejas microbiotas responsables del proceso. Se sabe que estas comunidades microbianas mayormente están conformadas por unas pocas especies de BAA, aerobias estrictas y principales responsables del mencionado proceso (Gullo et al., 2014; Peters et al., 2017). No obstante, fracciones menores tanto de BAA como de otros microorganismos pueden coexistir en el medio con las especies predominantes y contribuir a la función de la comunidad (Trček et al., 2016; Peng et al., 2021). Los miembros de estas microbiotas y, especialmente, las BAA, debido a sus condiciones de crecimiento tan particulares basadas principalmente en la necesidad de un medio líquido rico en etanol como fuente de carbono, homogéneo y con constante aporte de oxígeno disuelto, son difíciles de aislar y cultivar fuera de estos entornos dónde normalmente realizan su actividad (Mamlouk and Gullo, 2013; Gullo et al., 2014). En este contexto, la identificación, así como los estudios de biodiversidad y comportamiento de estos microorganismos a nivel molecular plantean numerosas dificultades. Estos aspectos no sólo implican un desafío para mejorar la comprensión de conceptos científicos-básicos de estas bacterias, sino que dificultan el control de la calidad final de los productos obtenidos, ya que depende de la composición microbiana, la materia prima y las condiciones operativas (Mas et al., 2014). En el contexto que se plantea, las ciencias ómicas ofrecen en la actualidad múltiples posibilidades para la identificación y caracterización de comunidades microbianas en su medio natural, sin necesidad de aislamiento. En el campo de la producción de vinagre, los estudios existentes están mayormente centrados en metagenómica y/o metabolómica de vinagres tradicionales, tanto aquellos obtenidos mediante fermentación en estado sólido como en superficie, así como estudios moleculares de especies concretas (Xia et al., 2016; Peters et al., 2017; Wu et al., 2017; Zhu et al., 2018; Wang et al., 2021). Este trabajo, enfocado en el uso del cultivo sumergido como método de producción y numerosas herramientas ómicas, pretende contribuir a ampliar el conocimiento actual que existe en esta área de investigación. Contenido de la investigación: En la presente Tesis Doctoral, se caracterizó y comparó el desarrollo de tres perfiles de acetificación para estudiar la evolución de las variables del sistema y el efecto de las tres materias primas empleadas: un medio sintético de alcohol, un vino fino y una cerveza artesana, sobre la composición y la actividad de la microbiota responsable del proceso. Con este objetivo, se emplearon diferentes herramientas ómicas basadas en metaproteómica (LC-MS/MS), metagenómica (secuenciación del ARNr 16S), huella de proteínas (MALDI-TOF MS) y metabolómica (SBSE acoplada con GC-MS), así como el cultivo sumergido, trabajando en modo semicontinuo, para la producción de vinagre a escala de laboratorio, tratando de imitar los procedimientos industriales. En primer lugar, la caracterización de los perfiles de acetificación de las materias primas de trabajo, desde un enfoque metaproteómico, permitió describir la composición y el comportamiento de la microbiota responsable del proceso. El género Komagataeibacter, representado principalmente por la especie Komagataeibacter europaeus y seguida de otras especies relacionadas, conformaron la microbiota predominante. Adicionalmente, este análisis reveló una fracción menor de microorganismos compuesta por géneros típicos de la familia Acetobacteraceae, nunca descritos en vinagre hasta la fecha. Posteriores estudios de metagenómica y huella proteica confirmaron la predominancia del género Komagataeibacter y permitió describir nuevos géneros bacterianos en estos medios e incluso grupos de arqueas. A partir de los estudios de metaproteómica, análisis cuantitativos centrados en el perfil de proteínas de la especie mayoritaria, K. europaeus, permitieron diferenciar entre los principales procesos biológicos que tienen lugar a lo largo del ciclo de acetificación en base a las variaciones en la actividad de las proteínas asociadas. Los resultados procedentes de la caracterización y comparación de dos perfiles de acetificación de materias primas naturales: vino fino y cerveza artesana, permitieron sugerir una estrategia molecular en la que K. europaeus puede asegurar su supervivencia a través del uso de nutrientes presentes en cada sustrato. En base a ello, la metabolización del ácido acético, procedente de la oxidación incompleta del etanol, mediante el ciclo de Krebs y otras vías metabólicas relacionadas (ruta de las pentosas fosfato y glucolisis), suministrando precursores biosintéticos (aminoácidos y ácidos nucleicos), así como mecanismos de membrana para liberar el ácido acético, pueden ser procesos de interés biotecnológico para la producción de vinagre mediante cultivo sumergido. Por último, un estudio preliminar a nivel metabolómico condujo a la caracterización del “volatiloma” y la diferenciación de volátiles minoritarios clave tanto de las materias primas como de las respectivas acetificaciones, permitiendo establecer diferencias significativas, siendo éstas más evidentes entre el medio sintético y los medios naturales. Conclusión: La investigación realizada en este trabajo ha permitido caracterizar y confirmar la composición de la microbiota presente durante tres perfiles de acetificación, con K. europaeus como especie predominante seguida de una fracción menos abundante de microorganismos como especies estrechamente relacionadas, especies de otros géneros típicos de BAA, grupos bacterianos diferentes a las BAA e incluso arqueas. Desde un punto de vista cuantitativo, se ha demostrado que el uso de diversas materias primas no influye directamente en la composición microbiana, mayormente común, pero sí en la actividad, comportamiento y estrategias moleculares empleadas durante la acetificación. Estos hallazgos pueden contribuir a mejorar el conocimiento actual que existe acerca de la composición y el papel de las comunidades microbianas responsables del proceso de acetificación, así como ampliar el uso de nuevas materias primas para la elaboración de vinagre mediante cultivo sumergido. A su vez, estos logros podrían conducir a la mejora de las condiciones de operación para la obtención de nuevos tipos de vinagre con mejores propiedades organolépticas y calidad.