Propionibacterium freudenreichii -bakteerien esiintyminen kypsytetyissä juustoissa ja kantojen ominaisuuksien karakterisointi | Presence of Propionibacterium freudenreichii in ripened cheeses and characterization of strains

Propionibacterium freudenreichii on tunnettu sekundäärinen hapatebakteeri, joka esiintyy pieninä määrinä spontaanisti raakamaidossa. P. freudenreichii -bakteerien sekä muiden mikrobien kontaminoitumista raakamaitoon voi tapahtua niin lypsyn, kuljetuksen kuin prosessoinnin aikana, joko ilmasta tai pintojen kautta. Raakamaitoon spontaanisti päätyneet mikrobit säilyvät hengissä pastörointia miedommista kuumennuskäsittelyistä, jonka vuoksi raakamaidosta valmistettujen juustojen mikrobiomi on monimuotoisempi kuin pastöroidusta maidosta valmistetuissa juustoissa, joissa korkeampi kuumennuslämpötila inaktivoi entsyymit ja tappaa patogeenien lisäksi muita mikrobeja. Juuston kypsytyksen eri vaiheissa mikrobistossa tapahtuu paljon muutoksia. Tutkielman tavoitteena oli kartoittaa raakamaidosta valmistettujen juustojen maitohappobakteerien ja propionibakteerien esiintymistä ja määriä viljelemällä näytteitä erilaisilla kasvatusalustoilla, sekä tunnistaa P. freudenreichii -bakteereita polymeraasiketjureaktion (PCR) perustuvan menetelmän ja P. freudenreichii -spesifisten alukkeiden avulla. Tämän lisäksi valituista P. freudenreichii -kannoista tutkittiin niiden kykyä tuottaa B12-vitamiinia nestegromatografiaan perustuvalla menetelmällä sekä selvitettiin kuinka eri NaCl-pitoisuudet vaikuttavat isolaattien kasvuun. Pesäkelukumääritysten perusteella tutkittujen juustojen bakteerimäärissä oli eroja. Valituista katalaasipositiivisista ja P. freudenreichii -bakteereita pesäkemorfologisesti muistuttavista isolaateista 65 % tunnistettiin P. freudenreichii -kannoiksi PCR:n avulla. Eniten P. freudenreichii -kantoja tunnistettiin Vorarlberger Bergkäs- sekä Liechtensteiner- juustonäytteiden isolaateista (92–94 %). Vähiten P. freudenreichii -kantoja tunnistettiin Tete de Moine -juustonäytteiden isolaateista (25 %). Mahdollisesti Vorarlberger Bergkäs- sekä Liechtensteiner -juustoissa oli enemmän P. freudenreichii -bakteereita suhteessa muihin pesäkemorfologialtaan P. freudenreichii -bakteereita muistuttaviin propionibakteereihin ja vastaavasti Tete de Moine juustossa P. freudenreichii -bakteerien osuus kaikista propionibakteereista oli pienempi. Kasvukokeiden perusteella suolapitoisuuden nostaminen kasvualustalla hidasti P. freudenreichii -isolaattien kasvua ja laski pesäkkeiden värin intensiteettiä. Vitamiinimääritysten perusteella kaikki 14 testattua P. freudenreichii -kantaa/isolaattia tuottivat ihmiselle aktiivista B12-vitamiinia, mutta tuotetuissa vitamiinimäärissä oli kantakohtaisia eroja. Myös tuotettujen vitamiinimuotojen (B12-vitamiini/pseudovitamiini) suhteissa havaittiin kantakohtaisia eroja.

Propionibacterium freudenreichii is a known as secondary ripening culture that occurs spontaneously in small amounts in raw milk. Contamination of raw milk with P. freudenreichii and other microbes can occur during milking, transporting and processing, either from the air or through surfaces. Microbes that spontaneously end up in raw milk survive on heat treatments that are milder than pasteurization, which makes the microbiome of raw milk cheeses more diverse than cheeses made from pasteurized milk, where a higher heating temperature inactivates enzymes and kills microbes. During the ripening of the cheese, a lot of changes occur in the microbiome. The aim of this master thesis was to discover the presence and number of lactic acid bacteria and propionic bacteria in raw milk cheeses by culturing samples in different culture media, and to identify P. freudenreichii by using a polymerase chain reaction (PCR) method and P. freudenreichii -specific primers. In addition, selected P. freudenreichii strains were tested for their ability to produce vitamin B12 by liquid chromatography and the effects of different NaCl concentrations on the growth of P. freudenreichii isolates were investigated. There were differences in the number bacterial colony forming units of the cheeses. Of the selected catalase-positive isolates resembling P. freudenreichii isolates morphologically, 65% were identified as P. freudenreichii strains by PCR. Most strains of P. freudenreichii were identified from isolates of Vorarlberger Bergkäs and Liechtensteiner cheese samples (92–94%). The least strains of P. freudenreichii were identified from isolates of Tete de Moine cheese samples (25%). Possibly Vorarlberger Bergkäs and Liechtensteiner cheeses had more P. freudenreichii bacteria compared to other propionic bacteria with similary colony morphology, and Tete de Moine had less of P. freudenreichii bacteria than other propionic bacteria. Based on growth experiments, increasing the NaCl content on agar plates slowed the growth of P. freudenreichii strains and impaired the color of the colonies. Based on the vitamin assays, all 14 strains of P. freudenreichii tested produced active vitamin B12 in humans, but there were differences in the amounts of vitamins produced per strain. Strain-specific differences were also observed in the ratios of vitamin forms produced (vitamin B12 / pseudovitamin).