Rubus ulmifolius Schott: aspetos químicos, propriedades bioativas e desenvolvimento de um corante natural a partir dos seus frutos

A cor tem sido considerada a característica mais importante num alimento, dado que gera expectativas acerca da palatabilidade, sendo determinante para a aceitabilidade e consumo por parte do consumidor. No sentido de fornecer ao consumidor produtos mais saudáveis, a indústria alimentar tem demostrado elevado interesse na substituição de aditivos artificiais por alternativas naturais, a fim de promover uma melhor qualidade dos produtos. A espécie Rubus ulmifolius Schott é conhecida pelos seus frutos - a amora silvestre, os quais apresentam um grande teor em compostos bioativos, nomeadamente corantes naturais, como as antocianinas. Neste trabalho foi estudado o perfil químico e nutricional dos frutos de R. ulmifolius, assim como o seu potencial bioativo, através de ensaios de citotoxicidade e atividade antimicrobiana. Foi efetuada também a otimização do processo de extração de antocianinas através de uma técnica assistida por calor (HAE), usando um método de análise de superfície de resposta. O extrato rico em compostos antociânicos, obtido no final do processo, foi avaliado em termos do seu potencial corante (medição da cor do extrato e quantificação dos compostos antociânicos) e da sua bioatividade (citotoxicidade e atividade antimicrobiana) e incorporado num produto de pastelaria – “donuts”. O valor nutricional da amostra foi analisado utilizando metodologias oficiais de análise de produtos alimentares (AOAC), evidenciando-se um perfil nutricional rico em hidratos de carbono e baixo em gordura. No estudo da composição química, os açúcares foram avaliados através de um sistema de HPLC-RI, os ácidos orgânicos por UFLC-DAD, os tocoferóis por HPLC-fluorescência e os ácidos gordos por GC-FID. Na análise relativa ao perfil de açúcares livres, foram detetadas as moléculas de frutose, glucose e sacarose, evidenciando-se a frutose como o composto presente em maior concentração. No que concerne aos ácidos orgânicos, foram identificados os ácidos oxálico, málico, chiquímico, ascórbico, fumárico e quínico, destacando-se este último, com o teor mais elevado. A análise ao perfil de ácidos gordos, identificou 25 compostos distintos, maioritariamente polinsaturados, destacando-se o ácido linoleico (C18:2n6) com a maior concentração. Além disso, os frutos apresentaram todas as isoformas de tocoferóis, α-, β-, γ- e δ-tocoferol, sendo o γ-tocoferol o vitámero maioritário. Na determinação da composição fenólica, após a sua análise por HPLC-DAD-ESI/MS, os frutos de R. ulmifolius revelaram a presença de 11 compostos fenólicos não antociânicos, salientando-se o pentósido do ácido elágico e 5 compostos antociânicos, destacando-se a cianidina-3-O-glucósido. As antocianinas foram as moléculas encontradas em maior concentração no extrato dos frutos de R. ulmifolius. O potencial bioativo, foi avaliado através de ensaios in vitro, através de 2 parâmetros: a atividade citotóxica, utilizando quatro linhas celulares tumorais humanas (HepG2, NCI-H460, MCF-7 e HeLa) e a uma cultura de células primárias não tumorais (PLP2; células de fígado de porco), aplicando o ensaio da sulforrodamina B; e a atividade antimicrobiana, aplicando o método de microdiluição em bactérias Gram-positivo e Gram-negativo, e numa estirpe de fungo. Os resultados demonstraram que a nível citotóxico as amostras não revelaram qualquer capacidade anti-proliferativa em nenhuma das linhas celulares testadas, mas também não manifestaram toxicidade nas células não-tumorais. Quanto à atividade antimicrobiana obtiveram-se resultados promissores, tendo os extratos exibido um efeito bacteriostático e fungistático, com valores de CMI (concentração mínima inibitória) entre 5 e 20 mg/mL. Relativamente ao procedimento da otimização da extração para a obtenção de um extrato rico em antocianinas, o método utilizado determinou como condições ótimas de extração t = 20,0 ± 0,60 min, T= 56,87 ± 3,41 ºC e % de etanol = 46,07 ± 3,69. O processo de extração utilizado (HAE) conduziu a rendimentos satisfatórios com valores de 68,60 ± 3,54 %, obtendo-se para o mesmo um teor total de antocianinas de 33,58 mg AT/g E. A razão sólido-líquido determinada (S/L= 25 g/L), permitiu um processo mais rentável e sustentável. O extrato ótimo evidenciou potencial corante, obtendo-se níveis de antocianinas próximos dos previstos pelo modelo e o extrato apresentou uma coloração vermelho-bordô. A nível antimicrobiano, os valores de CMI oscilaram entre 2,5 e 20 mg/mL, sendo as estirpes MRSA e Morganella morganii as que sofreram mais efeitos bacteriostáticos (CMI= 2,5 mg/mL). Por outro lado, a nível do potencial citotóxico, o extrato manifestou capacidade anti-proliferativa em todas as linhas celulares tumorais testadas e ausência de toxicidade nas células não-tumorais. Quando se procedeu à incorporação do extrato rico em compostos corantes nos “donuts” foram obtidos resultados bastante promissores, nomeadamente na fixação da cor rosa/lilás na massa do produto alimentar e após cozedura, e preservação da mesma ao longo de 3 dias de armazenamento, sem alteração da composição nutricional. Os frutos da espécie R. ulmifolius provaram ser uma rica fonte de compostos antociânicos, sendo uma matriz natural promissora para futuras aplicações na indústria alimentar, com o intuito de substituir corantes artificiais.

Colour has been considered the most impressive attribute of foodstuffs, because it generates expectancies about palatability, determining consumers acceptability of the product. In order to provide healthier products, the food industry has been searching for natural alternatives to replace artificial additives, providing high quality foodstuffs. The species Rubus umifolius Schott, frequently known for its fruits - elmleaf blackberry, has been descrided to present a rich composition in bioactive compounds, namely natural colorants, such as anthocyanins. In the present study the chemical and nutritional profile of R. ulmifolius fruits were studied, as well as, its bioactive potential through antimicrobial and cytotoxic properties evaluation. An optimization of the extraction of anthocyanins, through a heat assisted extraction method (HAE), was also performed by using the response surface analysis methodology. The anthocianin rich extract obtained was evaluated concerning its colorant potential (color evaluation and quantification of anthocyanic compounds) and also its bioactivity (antimicrobial and cytotoxic activities), and then it was further incorporated into a bakery product - “donuts”. The nutritional value of the sample was analysed according to official methodologies of food analysis (AOAC), showing a high carbohydrate content with low-fat values. The chemical characterization was achieved through the analysis of free sugars by HPLC-RI, organic acids by UFLC-DAD, tocopherols by HPLC-FL, and fatty acids by GC-FID. Regarding sugars’ analysis, fructose, glucose and sucrose were the identified free sugars, highlighting fructose as the main molecule. Concerning organic acids, oxalic, malic, shikimic, ascorbic, fumaric, and quinic acids were identified, being quinic acid the most abundant. The fatty acids profile revealed the presence of 25 compounds, being mostly represented by polyunsaturated fatty acids, being linoleic acid (C18:2n6) the main molecule present. All tocopherol isoforms were detected (α-, β-, γ- e δ-tocopherol) in the fruits, with γ-tocopherol as the most abundant vitamer. The phenolic profile characterization was performed throught an HPLC-DAD-ESI/MS analysis, and R. ulmifolius fruits revealed the presence of 11 non-anthocyanin compounds, being ellagic acid pentoside the major compound, while 5 anthocyanin compounds were identified, being cyanidin-3-O-glucoside the main molecule, and with these compounds present in the highest concentration in R. ulmifolius fruits. The bioactive potential was evaluated using in vitro assays throught the analysis of two parameters: antimicrobial activity determined by the microdilution method using clinical isolated from Gram-positive and Gram-negative bacteria and a fungi strain; cytotoxicity in four human tumor cell lines (HepG2, NCI-H460, MCF-7 e HeLa) and in a primary non-tumor cell culture (PLP2; porcine liver cells), using sulforrodamine B assay. The antimicrobial activity revealed promising results, with good bacteriostatic and fungistatic effects (MIC values ranging between 5 and 20 mg/mL). Concerning cytotoxic evaluation, the extract did not show any anti-proliferative activity in the tumor cell lines tested, but it also did not exhibit toxicity in the non-tumor cell culture. In relation to the extraction process otimization, in order to obtain an anthocyanin rich extract the optimum conditions applied were: t = 20.0 ± 0.60 min, T = 56.87 ± 3.41 °C and % ethanol = 46.07 ± 3.69. The HAE extraction process showed a relevant yield value of 68.60 ± 3.54%, being quantified a total anthocyanins’ content of 33.58 mg AT/g E. The solid-liquid ratio obtained (S/L = 25 g/L) allowed a more profitable and sustainable process. The optimized extract revealed a potent coloring capacity associated to its anthocyanin content, which was similar to those predicted by the RSM model system, revealing a red-burgundy color. The antimicrobial analysis of the optimized extract revealed higher MIC values, being MRSA and Morganella morganii the most suscetible strains (MIC= 2.5 mg/mL). On the other hand, the otimized extract exhibited an anti-proliferative activity in all the tumor cell lines tested, and absence of toxicity for non-tumor cells. When the extract rich in colorant compounds was incorporated in “donuts”, very promising results were obtained, namely regarding the coloring capacity of the extract, being able to give a pink/lilac color to the donuts after baking, and being able to estabilize the colour over 3 days of storage, without significant variation of the donuts nutritional value. R. ulmifolius fruits proved to be a rich source of anthocyanic compounds, being a pomissing natural matrices for future applications in the food industry to replace artificial food colorants.

Este trabalho é financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional Regional Norte 2020, no âmbito dos Projetos NORTE-01-0145-FEDER-023289 (DeCodE) e Norte-01-0247-FEDER-024479 (projeto Mobilizador ValorNatural®), e pelo programa FEDER-Interreg España-Portugal, no âmbito do projeto 0377_Iberphenol_6_E.