Actividade antimicrobiana do Vaccinium cylindraceum : estudo da resposta e adaptação ao stress por citometria de fluxo

Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar.

Actualmente verifica-se uma crescente preocupação relativamente aos conservantes sintéticos, e um número cada vez maior de consumidores opta por alimentos que contenham ingredientes naturais, ou seja, compostos com actividade antimicrobiana. Assim, o presente trabalho teve como objectivo o estudo da resposta ao stress e adaptação de células de Staphylococcus aureus, um dos patógenos responsável pela contaminação cruzada dos alimentos, ao extracto de Vaccinium cylindraceum, uma baga endémica dos Açores. O efeito do extracto nas células individuais de S. aureus foi estudado usando a capacidade de células desenergizadas em reter eficientemente a carboxifluoresceína (cF) como um indicador de actividade enzimática e de integridade da membrana, e a sua extrusão por transporte activo quando as células foram energizadas com glucose, como um indicador da capacidade de gerar energia metabólica. Verificou-se que o extracto de V. cylindraceum afecta a actividade metabólica das células de S. aureus, e que danifica a membrana citoplasmática, sugerindo que a dissipação do gradiente de membrana pode ser em parte responsável pela menor eficiência das células em gerar energia. A análise multiparamétrica por citometria de fluxo (CMF) de células de S. aureus crescidas na presença de extracto revelou que a população é heterogénea quanto à sua tolerância ao extracto de V. cylindraceum, tendo-se observado uma sub-população que se tornou mais robusta mantendo a integridade da membrana. No entanto, esta resposta adaptativa não foi evidente no que se refere à actividade metabólica destas células de S. aureus stressadas com V. cylindraceum. A análise por CMF de células marcadas com carboxifluoresceína diacetato (cFDA) e iodeto de propídio (IP) revelaram três subpopulações, i.e. células intactas (cF-fluorescentes), células danificadas (IP-fluorescentes) e células permeáveis (IP e cF-fluorescentes). Além do interesse fundamental subjacente à elucidação dos mecanismos envolvidos na resposta ao stress e adaptação de S. aureus ao extracto de V. cylindraceum alcançados no presente trabalho, fornecemos um método rápido para avaliar o estado fisiológico de células individuais de S. aureus, o que representa uma técnica poderosa para a indústria em termos de segurança alimentar.

ABSTRACT: The growing concern about synthetic preservatives leads to a growing number of consumers that require foods which contain natural ingredients, i.e., natural compounds with antimicrobial activity. Thus, the goal of the present work was to study the stress response and adaptation of Staphylococcus aureus cells, one of the pathogens responsible for food cross-contamination, to the extract of Vaccinium cylindraceum, an endemic berry from the Azores. The extract effects on S. aureus single cells was evaluated using the ability of de-energized cells to retain efficiently carboxyfluorescein (cF), as an indicator of enzymatic activity and membrane integrity, and the energy-dependent efflux of cF as an indicator for metabolic energy generation. V. cylindraceum extract clearly affected the metabolic activity of S. aureus cells and damaged the cytoplasmic membrane, suggesting that the dissipation of the proton motive force may be responsible for the less efficiency of cells in generating energy. Multiparametric flow cytometry (FCM) analysis of S. aureus cells grown in the presence of extract reveals a more robust sub-population, capable of maintaining membrane integrity. However this adaptive response was not observed in which regards the metabolic activity of V. cylindraceum stressed cells. FCM analysis of cells stained with carboxyfluorescein diacetate (cFDA) and propidium iodide (PI) revealed three sub-populations, i.e., intact cells (cF-fluorescent), damaged cells (PI-fluorescent) and cells permeable (PI and cF-fluorescent). Besides the fundamental interest underlying the elucidation of mechanisms involved in the stress response and adaptation of S. aureus cells to V. cylindraceum achieved in this work, it provides a rapid method to assess the physiological state of S. aureus single cells, representing a powerful technique for the industry in terms of food safety.