Enhancing Radiosensitivity of Murine Hepatocytes in Hypoxia through HIF-1α Depletion

Inglés. Hepatocellular Carcinoma (HCC) is a prevalent cancer affecting a significant number of individuals worldwide. Enhancing the efficacy of radiotherapy, a treatment modality for HCC which is under development, holds great potential for improving patient outcomes. In this study, we established cultured murine hepatocyte derived cells (mHDC) as an in vitro model and aimed to elucidate the impact of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha (HIF-1α) on DNA damage repair, radiation sensitivity, and cellular metabolism in murine hepatocyte-derived cells (mHDC). To better understand the role of HIF-1α, we developed an in vitro model using murine hepatocyte-derived cells (mHDC) that bear a complete knockout for HIF-1α. We assessed the impact of HIF-1α deficiency on DNA damage repair following ionizing radiation (IR) exposure under hypoxic conditions. Our findings revealed that HIF-1α deficiency increased IR-induced apoptosis and significantly reduced the surviving fraction of mHDC as compared to HIF-1α expressing cells in colony formation assays. Moreover, HIF-1α-depleted cells exhibited increased accumulation of IR-induced DNA damage, as evidenced by upregulated γH2AX foci. Furthermore, HIF-1α-deficient cells displayed delayed DNA repair after IR treatment in hypoxia, suggesting a potential effect on non-homologous end joining (NHEJ) repair capacity, as observed in neutral comet assays. Notably, there were no significant differences in reactive oxygen species (ROS) levels among the treatment groups, suggesting that the effects caused by HIF-1α deficiency are unlikely to be mediated by ROS. To further investigate the relationship between HIF-1α and cellular metabolism, we analyzed the respiratory metabolism and mitochondrial morphological changes in HIF-1α knockout cells. Interestingly, HIF-1α-deficient cells exhibited a significant increase in the oxygen consumption rate (OCR) and a reduction in the extracellular acidification rate (ECAR) compared to wildtype cells. Additionally, we observed alterations in mitochondrial morphology, with a decrease in the number of mitochondria following hypoxia, but an increase in knockout cells compared to wildtype cells. Collectively, our results suggest that HIF-1α inactivation enhances radiation sensitivity in mHDC cells, accompanied by an elevation in OCR and reduced glycolysis. These findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying radioresistance and metabolic changes in mHDC.

Alemán. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein weit verbreiteter maligner Tumor, der weltweit eine große Anzahl von Menschen betrifft. Die Verbesserung der Wirksamkeit der Strahlentherapie, einer Behandlungsmethode für HCC, die sich in der Entwicklung befindet, birgt ein großes Potenzial zur Verbesserung der Patientenergebnisse. In dieser Studie haben wir kultivierte aus Leberzellen generierte Hepatozyten Zellen (mHDC) aus Mäusen als in-vitroModell etabliert und die Auswirkungen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1 alpha (HIF-1α) auf die DNA-Schadenreparatur, die Strahlenempfindlichkeit und den Zellstoffwechsel in den mHDC untersucht. Um die Rolle von HIF-1α besser zu verstehen, haben wir ein in-vitro-Modell mit mHDC entwickelt, bei denen HIF-1α komplett ausgeschaltet ist. Wir haben die Auswirkungen des HIF- 1α-Mangels auf die DNA-Schadensreparatur nach Behandlung mit ionisierender Strahlung (IR) unter hypoxischen Bedingungen untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der HIF-1α-Mangel die durch IR ausgelöste Apoptose erhöhte und die überlebende Fraktion der mHDC im Vergleich zu HIF-1α exprimierenden Zellen in Koloniebildungsassays signifikant reduzierte. Darüber hinaus wiesen HIF-1α-depletierte Zellen eine erhöhte Anhäufung von durch IR verursachten DNA-Schäden auf, wie durch hochregulierte γH2AX-Foci belegt. Darüber hinaus zeigten HIF-1α-defiziente Zellen eine verzögerte DNA-Reparatur nach IR-Behandlung in Hypoxie, was auf eine potenzielle Auswirkung auf die Reparaturkapazität der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) hindeutet, wie in neutralen Kometenassays beobachtet wurde. Bemerkenswerterweise gab es keine signifikanten Unterschiede in den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zwischen den Behandlungsgruppen, was darauf hindeutet, dass die durch HIF-1α-Mangel verursachten Effekte wahrscheinlich nicht durch ROS vermittelt werden. Um die Beziehung zwischen HIF-1α und dem Zellstoffwechsel weiter zu untersuchen, haben wir den respiratorischen Stoffwechsel und die morphologischen Veränderungen der Mitochondrien in HIF-1α-Knockout-Zellen analysiert. Interessanterweise zeigten HIF-1α- defiziente Zellen eine signifikante Zunahme der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und eine Verringerung der extrazellulären Azidifizierungsrate (ECAR) im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Darüber hinaus beobachteten wir Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie, mit einer Abnahme der Anzahl von Mitochondrien nach Hypoxie, aber einer Zunahme in den Knockout-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Inaktivierung von HIF-1α die Strahlenempfindlichkeit in mHDC-Zellen erhöht, was einhergeht mit einer Erhöhung der OCR und einer verminderten Glykolyse. Diese Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die der Strahlenresistenz und den Stoffwechselveränderungen in mHDC zugrunde liegen.