Untersuchung ausgewählter pathogener und fakultativ pathogener Bakterien in der Ruhr

Alemán. In der Ruhr war das Baden für lange Zeit verboten, mittlerweile gibt es ein verstärktes Interesse, diesen Fluss zum Baden und für andere Freizeitaktivitäten zu nutzen. Hieraus ergibt sich ein potenzielles Gesundheitsrisiko, da mikrobiologische Pathogene in der Ruhr vorkommen und beim Baden zu Infektionen führen können. Eine Beurteilung der hygienischen Qualität erfolgt nach aktuell gültigen gesetzlichen Vorgaben anhand der Gehalte der Indikatororganismen E. coli und intestinalen Enterokokken über mehrere Badesaisons. Das Verbundprojekt „Sichere Ruhr“ befasst sich mit mikrobiologischen Risiken, die durch die Nutzung der Ruhr als Freizeit- und Badegewässer sowie als Trinkwasserreservoir entstehen. Diese Arbeit ist Teil dieses Verbundprojektes. Ziel dieser Arbeit ist die Quantifizierung bestimmter bakterieller Pathogene über einen repräsentativen Zeitraum, die Abschätzung von Erkrankungsrisiken mittels Daten aus epidemiologischen Untersuchungen und die Einordnung der Ergebnisse in Bezug auf das aktuelle Beurteilungskonzept der hygienischen Wasserqualität. Über einen Zeitraum von 18 Monaten wurden in 14-tägigen Abstand Ruhrwasserproben entnommen und mit kulturellen Verfahren hinsichtlich der Zielorganismen Aeromonas spp., Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp. und Salmonella spp. untersucht. Zusätzlich wurde ein Teil der Proben hinsichtlich des Vorkommens von Legionella spp. überprüft, hierbei wurden kulturelle und molekularbiologische Verfahren angewandt. Es wurden drei Proben von Flusssediment und epilithischen Biofilmen entnommen und ebenfalls mittels kultureller Verfahren hinsichtlich der Zielorganismen untersucht. Außerdem wurden Proben aus den Aufbereitungsstufen eines Ruhr-abhängigen Wasserwerks entnommen und mittels kultureller Verfahren die Reduktionsleistung der Zielorganismen bestimmt. Anhand einer Literaturrecherche wurden Anhaltspunkte für eine gesundheitliche Risikoabschätzung für die einzelnen Zielorganismen gesammelt und auf die gemessenen Konzentrationen übertragen. Mittels dieser Risikoabschätzung wurde das Konzept der Nutzung von Indikatororganismen zur Abschätzung des Gesundheitsrisikos evaluiert. Alle ausgewählten bakteriellen Pathogene konnten im Ruhrwasser nachgewiesen werden. Aeromonas spp. konnten in jeder Wasserprobe in Konzentrationen von 2,3 x 103 KBE/100 mL bis 7,7 x 105 KBE/100 mL mit einem Median von 2,1 x 104 KBE/100 mL nachgewiesen werden. In den warmen Monaten zeigten sich tendenziell höhere Konzentrationen. Zum Nachweis von Aeromonas spp. erwies sich eine Membranfiltrationsmethode unter Verwendung von Ampicillin-Dextrin-Agar als geeignet. Innerhalb von epilithischen Biofilmen und im Sediment wurde eine deutliche Anreicherung von Aeromonas spp. beobachtet P. aeruginosa konnte nicht in allen Proben nachgewiesen werden. Die Konzentration betrug im Median 1,6 MPN/100 mL, einige Proben zeigten Konzentrationen oberhalb der Quantifizierungsgrenze von 360 MPN/100 mL. Eine Membranfiltration auf CN-Agar nach DIN EN ISO 16266:2008 und eine Flüssiganreicherungsmethode nach DIN 38411-8:1982 lieferten hierbei vergleichbare Ergebnisse. Alternative Verfahren mittels MPN-Methode (Pseudalert®-System) oder mittels Membranfiltration unter Verwendung von RAPID'P.aeruginosa-Agar sollen die Untersuchungszeit auf einen Tag verkürzen, zeigten sich bei der Anwendung mit Oberflächenwasser mit starker Begleitflora als nicht geeignet. Eine Anreicherung dieses Bakteriums in Sedimenten und epilithischen Biofilmen war nachweisbar. Campylobacter spp. und Salmonella spp. wurden sporadisch in Konzentrationen bis zu 15 MPN/100 mL (Campylobacter) bzw. ≥ 37 MPN/100 mL (Salmonellen) gefunden. Es war eine Saisonalität mit höheren Nachweisraten und Gehalten im Herbst bzw. Winter zu beobachten. Beide Gattungen waren in Biofilmen nicht oberhalb der Nachweisgrenze 310 MPN/100 g FG messbar. Legionella spp. konnte kulturell in einer von 60 Oberflächenwasserproben mit 83 KBE/100 mL nachgewiesen werden, mittels qPCR gelang der Nachweis von Legionella spp. in allen Proben. Die mittels qPCR ermittelten Konzentrationen lagen zwischen 700 GU/100 mL und 140.000 GU/100 mL mit einem Median von 36.000 GU/100 mL. Die Spezies Legionella pneumophila war in 26 von 60 untersuchten Proben in Konzentrationen bis zu 18.000 GU/100 mL nachweisbar. Der ermittelte Anteil vitaler Zellen von Legionella spp. lag im Untersuchungszeitraum zwischen 3 % und 89 % (Median 18 %). Von der Spezies L. pneumophila konnten keine vitalen Zellen nachgewiesen werden. Innerhalb des Prozesses der Trinkwasseraufbereitung konnten P. aeruginosa, Campylobacter spp. und Salmonellen bereits nach der ersten Stufe (Langsamsandfiltration) nicht mehr nachgewiesen werden, für Aeromonas spp. zeigte sich nach dieser Aufbereitungsstufe eine Reduktion der Keimzahlen um 2 bis 3 log-Stufen. Nach Abschluss der Trinkwasseraufbereitung waren alle Zielorganismen nicht mehr nachweisbar. Für Aeromonas spp. sind in der Literatur Infektionen durch Wasserkontakt mit Haut und Schleimhäuten oder durch Aspiration von belastetem Wasser beschrieben. Eine quantitative Abschätzung des Risikos einer Infektion ist anhand der Literatur nicht möglich. In der Literatur wurden Infektionen durch P. aeruginosa bei Konzentrationen, die auch in der Ruhr gemessen wurden, beschrieben. Ursächlich ist das Eindringen des Bakteriums in aufgeweichte oder verletzte Haut, dieser Mechanismus ist bei Entzündungen des äußeren Gehörgangs von Bedeutung. Für Campylobacter spp. und Salmonella spp. wurde anhand der Literatur eine quantitative Risikoabschätzung vorgenommen. Das Erkrankungsrisiko am Tag der höchsten im Untersuchungszeitraum gemessenen Konzentration an Campylobacter spp. beträgt 0,9 % für Erwachsene und 1,8 % für Kinder bei einer Badezeit von 45 min. Mit der gleichen Berechnungsgrundlage konnten bei Salmonella spp. Erkrankungsrisiken von ≥ 0,08 % für Erwachsene und ≥ 0,2 % für Kinder ermittelt werden. Tendenziell waren die Konzentrationen der untersuchten Zielorganismen insbesondere in den Zeiten erhöht, in denen auch erhöhte Konzentrationen der Indikatororganismen E. coli und intestinale Enterokokken nachweisbar waren, die ein zeitweiliges Badeverbot bedingt hätten. Einige hohe Spitzenwerte bei den Zielorganismen traten aber auch bei geringeren Konzentrationen der Indikatoren auf. Bei Aeromonas spp. und Pseudomonas spp. bewirkt die Anreicherung innerhalb von Biofilmen, dass auch bei niedrigen Konzentrationen im Oberflächenwasser erhöhte Expositionen gegenüber diesen Organismen bei Kontakt mit diesen Biofilmen möglich sind. Zwar konnten Campylobacter spp. und Salmonella spp. nicht in Biofilmen nachgewiesen werden, dennoch kann aufgrund der hohen Nachweisgrenzen der Organismen in dieser Matrix deren Vorkommen nicht ausgeschlossen werden. Bei der Trinkwasseraufbereitung ist von einer ausreichenden Eliminierung der untersuchten Pathogene auszugehen. Insgesamt zeigte sich, dass ein Frühwarnsystem bezogen auf hohe Gehalte von Indikatorbakterien auch das Risiko einer hohen Exposition gegenüber anderen Pathogenen im Oberflächenwasser verringern kann. Die Exposition gegenüber Pathogenen in Biofilmen kann nicht ausreichend über die Messung von Indikatororganismen im Oberflächenwasser abgeschätzt werden. Die Erprobung eines semikontinuierlichen Messverfahrens und einer PCR-basierten Schnelltestmethode zeigte, dass diese die Konzentrationen der Indikatorbakterien nicht zuverlässig abbilden konnten. Innerhalb des Verbundprojektes wurde jedoch ein Frühwarnsystem zur Vorhersage einer schlechten Wasserqualität auf Basis von Niederschlagsdaten entwickelt.

Inglés. While bathing was prohibited in the River Ruhr for an extended period, there is now a growing interest in use of the river for bathing and further water sports. This poses a potential risk to health because of infections due to microbial pathogens present within the River Ruhr. Assessment of hygienic quality conforming to current regulations is based on concentrations of indicator organisms E. coli and intestinal enterococci comprising multiple bathing seasons. The joint project “Sichere Ruhr/Safe Ruhr“ approaches microbiological risks as a result of the River Ruhr used for recreational and bathing activities as well as source for drinking water production. This thesis is associated to the joint project. Quantification of selected bacterial pathogens over a representative period as well as assessment of illness using epidemiologic data and evaluation of hygienic quality in reference to current concepts are aims of this thesis. Water samples of the River Ruhr were collected bi-weekly for 18 months. The target organisms Aeromonas spp., Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter spp. und Salmonella spp. were analysed via culture based methods. Part of the samples were aditionally screened for Legionella spp. applying culture based and molecular methods Also, three samples of the river sediment and epilithical biofilms were taken for analysis of target organisms via culture-based methods. Additionally, samples within the process of drinking water treatment were obtained from a plant at the River Ruhr. The reduction factors of the target organisms were also determined by means of cultural methods. Based on a literature search, indications for a health risk assessment for the individual target organisms were established and transferred to the measured concentrations. The calculated health risks were used to evaluate the concept of indicator organisms for risk assessment. All selected bacterial pathogens were found in the water of the River Ruhr. Aeromonas spp. could be detected in each water sample in concentrations of 2.3 x 103 CFU/100 mL to 7.7 x 105 CFU/100 mL with a median of 2.1 x 104 CFU/100 mL. In the warm months, higher concentrations tended to appear. For analysis of Aeromonas spp., a membrane filtration method using ampicillin dextrin agar proved to be suitable. Within epilithic biofilms and in sediment, an accumulation of Aeromonas spp. was observed. P. aeruginosa could not be detected in all samples. The median concentration was 1.6 MPN/100 ml, some samples showed concentrations above the limit of quantification (360 MPN/100 mL). Membrane filtration on CN agar according to DIN EN ISO 16266:2008 and a liquid enrichment method according to DIN 38411-8:1982 provided comparable results. Alternative methods by MPN technique (Pseudalert®system) or by membrane filtration using RAPID'P.aeruginosa agar are intended to shorten the examination time to one day but were not suitable when used with surface water with strong accompanying flora. An accumulation of this bacterium in sediments and epilithic biofilms was detectable. Campylobacter spp. and Salmonella spp. were sporadically found in concentrations up to 15 MPN/100 mL (Campylobacter) and ≥ 37 MPN/100 mL respectively (Salmonella). A seasonality was observed with higher detection rates and levels in autumn and winter. Both genera were not measurable in biofilms above the limit of detection (310 MPN/100 g wet weight). Legionella spp. could only be detected in one of 60 surface water samples by applying culture-based methods in a concentration of 83 CFU/100 mL. Via qPCR the detection of Legionella spp. was possible in all samples. The concentrations determined by qPCR ranged from 700 GU/100 mL to 140,000 GU/100 mL with a median of 36,000 GU/100 mL. The species Legionella pneumophila was found in 26 of the 60 samples examined in concentrations up to 18,000 GU/100 mL. The determined proportion of vital cells of Legionella spp. varied between 3 % and 89 % (median 18 %). No vital cells of the species L. pneumophila could be detected. Within drinking water treatment, P. aeruginosa, Campylobacter spp. and Salmonella could no longer be detected after the first stage (slow sand filtration), for Aeromonas spp. a reduction by 2 to 3 log levels was apparent. After completion of the drinking water treatment, none of the target organisms were detected. Aeromonas spp. infections caused by water contact with the skin and mucous membranes or by aspiration of contaminated water have been described in literature. A quantitative assessment of the risk of infection is not possible based on literature. Infections by P. aeruginosa have been described at concentrations that were also measured in the River Ruhr. They are caused by the penetration of the bacterium into softened or injured skin. This mechanism is also important in inflammation of the external auditory canal. Regarding Campylobacter spp. and Salmonella spp., a quantitative risk assessment was carried out based on literature. The risk of illness on the day of the highest concentration of Campylobacter spp. measured during the study period was 0.9 % for adults and 1.8 % for children with a bathing time of 45 minutes. With the same calculation basis risks of illness of ≥ 0.08 % for adults and ≥ 0.2 % for children regarding Salmonella spp. was determined The concentrations of the target organisms tended to be increased at elevated concentrations of the indicator organisms E. coli and enterococci, especially in periods requiring a temporary bathing ban. However, some high peaks in target organism concentrations also occurred at lower levels of the indicators. Accumulation of A.spp and P.spp. in biofilms was detected. Increased exposures to these organisms by contact with biofilms are possible, despite concentrations in surface water may be low. Although Campylobacter spp. and Salmonella spp. could not be detected in biofilms, their occurrence cannot be ruled out due to the high detection limits of the organisms in this matrix. In drinking water treatment, sufficient elimination of the pathogens examined can be assumed. Overall, it was found that an early warning system based on high levels of indicator bacteria can also reduce the risk of high exposure to other pathogens in surface water. However, exposure to pathogens in biofilms cannot be sufficiently estimated by measuring indicator organisms in surface water. A semi-continuous measurement method and a PCR-based rapid test method could not map the concentrations of the indicator bacteria reliably. Within the joint project, however, an early warning system was developed to predict poor water quality based on precipitation data.