Altersbestimmung anhand der DNAMethylierung mittels Real-Time PCR und Pyrosequenzierung

Alemán. Die epigenetische Altersschätzung kann insbesondere für die forensische Genetik einen großen Nutzen darstellen. So könnte diese Methode für die Identifizierung unbekannter Leichen nützlich sein aber auch zu einem Informationsgewinn von an Tatorten gefundenen DNA-Spuren beitragen. Umso mehr stellen diese Einsatzmöglichkeiten hohe Anforderungen an diese Technik. So sollte die Altersschätzung sehr genau sein, eine hohe Sensitivität aufweisen, um in der Spurenanalytik angewendet werden zu können, und sie sollte in möglichst vielen verschiedenen Geweben einsetzbar sein. Diese Eigenschaften bedingen eine aufwändige Forschung und Etablierung dieser Methodik. In einer Vielzahl von Publikationen wurde diese Technologie mittels massiver paralleler Sequenzierung, Pyrosequenzierung und in vereinzelten Studien auch mittels SNaPshot-Analysen durchgeführt. Um das Spektrum der möglichen anwendbaren Laborgeräte zu erweitern, sollte innerhalb dieser Arbeit der Einsatz der Real-Time PCR für die Schätzung des biologischen Alters getestet werden und mit den Ergebnissen der Pyrosequenzierung verglichen werden. Dabei wurden geeignete altersabhängige CpG-Stellen gesucht, diese für beide Methoden etabliert und Schätzungsmodelle für zwei verschiedene Zellarten (Blut und Mundschleimhautepithelzellen) aufgestellt. Sowohl für die Verwendung von Mundschleimhautepithelzellen als auch für Blutproben sind kaum Unterschiede in den Schätzungsgenauigkeiten für die beiden Methoden zu erkennen. So schätzt die Real-Time PCR 50 % der MSA- bzw. Blutproben mit einer Abweichung zum chronologischen Alter von kleiner 5,9 bzw. 7,1 Jahren und die Pyrosequenzierung von kleiner 6,8 bzw. 8,1 Jahren. Die Schätzung des biologischen Alters in Mundschleimhautabrieben zeigt dabei bessere Ergebnisse. Einen Nachteil für die Real-Time PCR liegt in dem Design der fluoreszenzmarkierten Sonden, die zur Detektion des methylierten bzw. unmethylierten Cytosins verwendet werden. Hier zeigte sich, dass die Herstellung dieser Sonden für einige Altersmarker aufgrund zahlreicher, umliegender CpG-Stellen nicht möglich war, da diese die Bindung der Sonden beeinflusst hätten. Aus diesem Grund konnte der Einsatz der stark altersabhängigen CpG-Stellen des Gens ELOVL2 nicht in die jeweiligen Modelle für die Real-Time PCR eingebaut werden. Lediglich für die Pyrosequenzierung konnte gezeigt werden, dass sich die Schätzungsmodelle für beide Zellarten signifikant verbessern auf einen MAD von 5,2 Jahren (MSA) bzw. 5,4 Jahren (Blut). Die Auswahl der verwendeten Altersmarker ist also entscheidend für die Schätzungsgenauigkeit des Modelles. Obwohl die Modelle der Real-Time PCR im Rahmen dieser Studie nicht weiter optimiert werden konnten, zeigen die Ergebnisse, dass diese Methodik grundsätzlich eine geeignete Option für die Anwendung zur epigenetischen Altersschätzung darstellt. Durch die Testung weiterer altersabhängiger CpG-Stellen und die Erweiterung des Probenumfanges könnte die Schätzungsgenauigkeit weiter verbessert werden. Die Anwendung dieser Methodik in der Spurenanalytik ist jedoch nur im begrenzten Umfang möglich. Zum einen können nur Einzelspuren der jeweiligen Zellart untersucht werden, für die die jeweiligen Modelle vorliegen. Zum anderen muss eine ausreichende Menge an DNA-Material mit guter Qualität zur Verfügung stehen, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. So könnte der Einsatz altersabhängiger CpG-Stellen, die in vielen Zellarten eine identische DNA-Methylierung aufweisen, einige dieser Einsatzbeschränkungen überwinden. Aber auch ein Multiplex-Ansatz würde teilweise die Einsatzmenge an DNA verringern, sodass ein größerer Umfang an DNA-Spuren untersucht werden könnte. Mit der Erweiterung der DNA-Analyse von unbekanntem Spurenmaterial wird sich die Methodik der epigenetischen Altersschätzung auch in Zukunft weiterentwickeln und somit zu einem neuen und vielversprechenden Werkzeug in der DNA-Analytik werden.

Inglés. Epigenetic age estimation has great potential for forensic genetic analysis, particularly for identifying unknown corpses or significantly increasing the information content of unassigned DNA traces from a crime scene. Therefore, age estimation methods require high precision and sensitivity. Moreover, any technique should be applicable in different tissues, thus resulting in an elaborate establishment process. The analysis of age-associated DNA methylation can be conducted by massive parallel sequencing, pyrosequencing and by minisequencing approaches as already reported in several publications. In this PhD thesis the applicability of real-time PCR is tested and the results compared with those of pyrosequencing techniques. Therefore, age-associated CpG sites were tested and established for both methods to build up age prediction models based on two different cell types (blood and buccal epithelial cells). The results showed hardly any differences in the estimation accuracy between both cell types with a mean absolute difference of 5.9 and 7.1 years for the real-time PCR, and 6.8 and 8.1 years for the pyrosequencing in buccal swabs and blood samples, respectively. The design of fluorescent labelled probes for the real-time PCR analysis to detect methylated and unmethylated cytosines was not possible for some markers due to several additional CpG sites around the CpG site of interest. Therefore, the highly age-dependant CpG sites of ELOLV2 could only be included in pyrosequencing prediction models and not in those using real-time PCR. As a result, the pyrosequencing models for blood and buccal swab samples showed a significant improvement regarding the mean absolute difference (a decrease to 5.4 years for blood and 5.2 years for buccal swabs) thus confirming the importance of age marker selection. The results of this study demonstrated that estimating biological age using real-time PCR is basically suitable, even though the prediction models for real-time PCR could not be further optimized. By extending the prediction model with more age markers and including more samples, the accuracy of estimating age could be improved. In general, the application of age estimation in routine forensic work and analysis of traces is limited. On the one hand, the DNA methylation status of mixed traces derived from more than one individual and / or more than one cell type cannot be reliably determined. On the other hand, the requirements regarding the quality and quantity of the DNA are very high. Nevertheless, these limitations could be overcome by using CpG sites with a very similar age dependence in different cell types or by applying a multiplex approach to amplify several CpG markers in one assay. Since the determination of the biological age of unknown DNA material could now be legally performed in the prosecution of criminal acts, this method will continue to develop and will become a new and promising element of forensic DNA analysis.