Targeting liposarcoma by various therapeutic approaches with concurrent exploitation of genetic aberrations

Inglés. Following the failure of the standard modalities (surgery, chemotherapy, and radiotherapy) for long-term eradication of tumors, tumor-specific targeted therapies emerged for the treatment of patients with liposarcoma in particular of subtype welldifferentiated/de-differentiated (WD/DDLPS). Therapeutic approaches with single agents targeting the activity of the key disease-related oncogene products MDM2 or CDK4 displayed encouraging results. However, the clinical efficacy of these pharmacological inhibitors is still quite limited. To this end, based on the presence of the genetic abnormalities, several rationales were designed to combine such inhibitors with concurrent application of existing therapies (radiotherapy, immunotherapy) in order to achieve an improved response. In parallel, the therapy-driven modulation of signaling pathways and phenotypic cellular fates were studied in a set of liposarcomaderived cell lines in vitro. Based on the presence of key oncogenes, it was examined whether co-inhibition of CDK4 and MDM2 led to an enhanced anti-proliferative efficacy in liposarcoma cell lines. The findings of the study demonstrated unperturbed signaling pathways with non-additive effects by co-inhibition. This study also indicated MDM2-mediated degradation of the retinoblastoma (RB) protein, which might have rendered the cells insensitive to CDK4 inhibitors. However, sequence alteration of inhibitors revealed no significant enhancement of growth inhibition, which indicated RB degradation not to be the primary cause of observed non-additivity. Thus, it could be stated that co-targeting of CDK4 and MDM2 might not exert a synergistic growth inhibition in liposarcoma cells. Next, it was evaluated whether MDM2 inhibition in TP53 wild-type liposarcoma cell lines enhanced the susceptibility of tumor cells to the treatment with ionizing radiation. It was hypothesized that MDM2 inhibition would disrupt the MDM2-p53 interaction and reactivate the wild-type functional p53. Addition of radiation treatment would further augment this restoration of functional p53 which might lead to enhanced p53-mediated cellular fates. To prove this, TP53 wild-type and TP53 mutant liposarcoma cell lines were tested. The results of this study demonstrated an in vitro radio-sensitization of two of the cell lines harboring wild-type TP53 by MDM2 inhibition. Apoptosis remained unperturbed but increased senescence-mediated terminal fate was observed in response to combination treatment. An enhanced upregulation of MDM2-p53-p21signaling axis was noted concomitantly. In contrast, cells with mutant TP53 were not susceptible to radiation following MDM2 inhibition. Furthermore, TP53 mutant cells displayed unperturbed signaling, apoptosis, and senescence confirming the requirement of functional TP53 for radio-sensitization. Assessment of cell cycle markers and DNA content analysis revealed the emergence of p53-dependent ploidy based clonal heterogeneity in response to the MDM2 inhibitors in absence or presence of radiation in all cell lines with wild-type TP53. Relative abundance of 4N and >4N populations were evident in response to the combination treatment. Sorting and eventual fate analysis of these polyploid subpopulations displayed attenuated cloneforming ability and increased senescence in the two cell lines with wild-type TP53 that displayed radio-sensitization. Thus, combined therapy-driven relative abundance of the polyploid populations and their attenuated clone -forming ability with concomitant senescence led to the ultimate effect. However, in one of the liposarcoma cell lines (with wild-type TP53) which was not susceptible to radiation following blockade of MDM2, sorting and long-term fate analysis of the polyploid cells displayed survival and no senescence induction. Thus, this study indicates functional p53 as a prerequisite for the response but not the sole determinant and p53-independent factors might govern the final fate. Next, the vulnerability of the liposarcoma cell lines to ionizing radiation was tested following treatment with CDK4 inhibitors. The results of the study demonstrated CDK4 inhibition did not lead to radio-sensitization of liposarcoma cell lines. Thus, this combination might not be considered as a promising therapeutic approach. Next, the therapy-driven expression pattern of the NKG2D ligands and DNAM-1 ligands in liposarcoma cell lines was elucidated for targeting them to subsequent allogeneic NK cell-mediated recognition and lysis. The findings of the study demonstrated increased and decreased expressions of activator NKG2D ligands and the inhibitory NK cell ligand, respectively, in one of the cell lines derived from primary liposarcoma tumors, following functional block of CDK4 and MDM2. However, functional assays by primary NK cell-mediated lysis of tumor cells demonstrated enhanced death of tumor cells in the untreated group. Thus, further investigation about the intrinsic modulation/expression of NKG2D-independent activation ligands and other inhibitory NK cell ligands in liposarcoma cell lines is mandatory. Altogether, these data explain 1) toward potential efficacies or failures elicited by inhibitors targeting the tumor-specific genetic background and 2) how targeted therapy -driven modulation of the pathways in liposarcoma cell lines make them vulnerable to existing therapeutic modalities. The findings of this study also aid to better understand how new therapies could be selected over the existing ones or potential modifications that are pre-requisites for an improved response.

Alemán. Nach den unbefriedigenden Erfolgen der Standardverfahren (Operation, Chemotherapie und Strahlentherapie) zur langfristigen Behandlung von Liposarkomen, wurden gezielt tumorspezifische Therapien für die Behandlung von Patienten mit Tumoren insbesondere des Subtyps gut differenziert / de-differenziert (WD / DDLPS) entwickelt. Therapeutische Ansätze mit Einzelwirkstoffen, die auf die Aktivität der wichtigsten krankheitsrelevanten Onkogenprodukte MDM2 oder CDK4 abzielten, zeigten vielversprechende Ergebnisse. Jedoch ist die klinische Wirksamkeit der eingesetzten pharmakologischen Inhibitoren noch sehr begrenzt. Deshalb wurden aufgrund der genetischen Anomalien in dieser Arbeit verschiedene Ansätze entwickelt, um solche Inhibitoren mit gleichzeitiger Anwendung bestehender Therapien (Strahlentherapie, Immuntherapie) zu kombinieren, um eine verbesserte Wirkung zu erzielen. Parallel dazu wurde die Therapie-gesteuerte Modulation von Signalwegen und der Phänotyp des induzierten Zelltods in einer Reihe von Liposarkom-abgeleiteten Zelllinien in vitro untersucht. Basierend auf der Anwesenheit von Schlüssel-Onkogenen wurde untersucht, ob die Ko-Inhibierung von CDK4 und MDM2 zu einer verstärkten anti-proliferativen Wirkung bei Liposarkom-Zelllinien führte. Die Ergebnisse der Studie zeigten ungestörte Signalwege mit nicht-additiven Effekten durch die Ko-Inhibierung beider Proteine. Darüber hinaus deutet die Studie auch auf einen MDM2-vermittelten Abbau des Retinoblastom (RB) -Proteins hin, der die Zellen gegenüber CDK4-Inhibitoren unempfindlicher gemacht haben könnte. Die Sequenzveränderung der Inhibitoren zeigte jedoch keine signifikante Verstärkung der Wachstumshemmung, was darauf hinweist, dass der RB-Abbau nicht der Hauptgrund für die beobachtete Nichtadditivität ist. Somit kann gefolgert werden, dass ein “Co-Targeting“ von CDK4 und MDM2 keine synergistische Wachstumshemmung in Liposarkomzellen ausübt. Als nächstes wurde untersucht, ob die MDM2-Hemmung in TP53-Wildtyp-Liposarkom-Zelllinien ihre Empfindlichkeit gegenüber der Behandlung mit ionisierender Strahlung erhöhte. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die MDM2-Inhibierung die MDM2-p53-Interaktion unterbrechen und das Wildtyp-funktionelle p53 reaktivieren würde. Der Zusatz von Strahlentherapie würde diese Wiederherstellung von funktionellem p53 weiter verstärken, was zu einem verstärkten p53-vermittelten Zelltod führen könnte. Um diese Hypothese zu beweisen, wurden TP53-Wildtyp- und TP53-mutierte Liposarkom-Zelllinien untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine durch MDM2-Hemmung herbeigeführte radiosensitivierung von zwei der Zelllinien mit Wildtyp-TP53. Die Apoptose blieb ungestört, jedoch wurde ein erhöhtes Seneszenzvermitteltes terminales Schicksal als Reaktion auf eine Kombinationstherapie beobachtet. Gleichzeitig wurde eine verstärkte Hochregulation der MDM2-p53-p21-Signalachse beobachtet. Im Gegensatz dazu waren Liposarkomzellen mit mutiertem TP53 nach MDM2-Inhibierung nicht erhöht Strahlungs-empfindlich. Darüber hinaus zeigten TP53-Mutantenzellen ungestörte Signalgebung, Apoptose und Seneszen, was bestätigt, dass für die Radio-Sensitivierung funktionelles TP53 erforderlich ist. Die Auswertung von Zellzyklusmarkern und die DNA-Gehaltsanalyse zeigten das Auftreten von p53-abhängiger Ploidie-basierter klonaler Heterogenität als Reaktion auf die MDM2-Inhibitoren in Abwesenheit oder Anwesenheit einer Strahlentherapie in allen Zelllinien mit Wildtyp-TP53. Die relative Häufigkeit von 4N- und >4NPopulationen war als Reaktion auf die Kombinationsbehandlung offensichtlich. Sortierung und Zelltodanalyse dieser polyploiden Subpopulationen zeigten jeweils abgeschwächte Klon-bildende Fähigkeit und erhöhte Seneszenz in den zwei Zelllinien mit Wildtyp-TP53, welche eine Radio-Sensitivierung zeigten. Die kombinierte therapiegetriebene relative Häufigkeit der polyploiden Populationen und ihre reduzierte Klonbildungsfähigkeit mit gleichzeitiger Seneszenz führten zu dem letztendlichen Effekt. In einer der Liposarkom-Zelllinien (mit Wildtyp-TP53), die nach Blockade von MDM2 nicht bestrahlungsempfindlicher war, zeigte die durch FACSSortierung isolierte polyploiden Zellfraktion ein Langzeit-Überleben und keine Seneszenz-Induktion. Diese Befunde weisen darauf hin, dass funktionelles p53 zwar eine Voraussetzung, aber nicht die alleinige Determinante für eine MDM2-abhängige Resistenz gegenüber ionisierender Strahlung ist, sondern weitere p53-unabhängige Faktoren das Zellschicksal bestimmen. Als nächstes wurde die Empfindlichkeit der Liposarkom-Zelllinien gegenüber ionisierender Strahlung nach Behandlung mit CDK4-Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass die CDK4-Inhibierung nicht zu einer Radio-Sensitivierung der Zellen führte. Daher kann diese Kombination nicht als sinnvoller therapeutischer Ansatz angesehen werden. Zuletzt wurden Behandlungs-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster der NKG2D und DNAM-1-Liganden in Liposarkom-Zelllinien untersucht, um den möglichen Einfluss auf eine nachfolgende allogene NK-Zell-vermittelte Erkennung und Lyse zu analysieren. Die Ergebnisse der Studie zeigten nach dem funktionellen Block von CDK4 und MDM2 erhöhte und verringerte Expressionen von Aktivator-NKG2DLiganden bzw. dem inhibitorischen NK-Zell-Liganden in einer der Zelllinien. Funktionelle Tests durch primäre NK-Zell-vermittelte Lyse der Tumorzellen zeigten jedoch einen verstärkten Zelltod lediglich in der unbehandelten Gruppe. Daher sind weitere Untersuchungen zur intrinsischen Modulation / Expression von NKG2Dunabhängigen Aktivierungsliganden und anderen inhibitorischen NK-Zell-Liganden in Liposarkom-Zellinien erforderlich. Insgesamt erklären diese Daten 1) potentielle Wirksamkeiten oder Ausfälle, die durch Inhibitoren hervorgerufen werden, die auf den tumorspezifischen genetischen Hintergrund abzielen, und 2) wie eine gezielte Therapie-gesteuerte Modulation der Signalwege in Liposarkom-Zelllinien diese für bestehende therapeutische Modalitäten anfällig macht. Die Ergebnisse dieser Studie tragen auch dazu bei, besser zu verstehen, wie neue Therapien gegenüber den bestehenden Therapien ausgewählt werden können oder welche möglichen Änderungen für eine verbesserte Reaktion erforderlich sind.