Etablierung eines caprinen Infektionsmodells für die Paratuberkulose sowie Nachweis und Charakteristik der spezifischen Immunantwort gegenüber Mycobacterium avium spp. paratuberculosis (MAP) unter Berücksichtigung verschiedener diagnostischer Fragestellungen | Introduction of a caprine infection model for paratuberculosis, detection and characterisation of cellular and humoral immune response considering specific diagnostic questions

Alemán. Die Diagnostik in Frühstadien der Paratuberkulose ist nicht sicher möglich. Dies beruht auf dem unzureichenden Verständnis der Pathogenese der Erkrankung. Es fehlen außerdem sensitive und spezifische diagnostische Methoden. Als potentieller Test gilt der IFN-y-Assay, für den jedoch spezifische Restimulationsantigene fehlen. Es ist unbekannt, ob sich weitere Zytokine für die Diagnostik eignen. Um pathogenetische Fragestellungen zu beantworten und diagnostische Tests zu entwickeln und zu evaluieren, sollte ein sicheres, international vergleichbares Langzeitinfektionsmodell an der Thüringer Wald Ziege entwickelt und ein geeigneter Inokulationsmodus gefunden werden. Die Studie diente auch dazu, die zelluläre und humorale Immunantwort zu charakterisieren und Zusammenhänge zur Ausscheidung des Erregers und den pathohistologischen Befunden darzustellen. Insbesondere der Übergang von der zellulären zur humoralen Immunantwort war von Interesse. Weiterhin sollte die Sensitivität des IFN-y-Tests durch Neutralisation von IL-10 verbessert werden. Es wurden vier rekombinant hergestellte MAP-Proteine auf ihre Eignung als spezifische Antigene in diesem Test untersucht. Anhand der Genexpression von IFN-y, IL-10, TNFa, TGFß und IL-12p40 sollten für MAP-Infektionen typische Zytokinmuster erstellt und auf ihre diagnostische Eignung untersucht werden. Es wurde ein Infektionsmodell etabliert, das internationalen Standards entspricht. Die Infektion gelang bei 96 % der Versuchstiere. Die gewählten Inokulationsdosen (Unterschied um den Faktor zwei) führten ebenso wie die gewählten Inokulationszeitpunkte (Abstand von 29 Tagen innerhalb der ersten vier Lebenswochen) nicht zu Unterschieden in der Erregerausscheidung und der zellulären und humoralen Immunantwort. Die frühe Inokulation mit der höheren Dosis bewirkte bei einigen Tieren möglicherweise einen Thiaminmangel. Nach einer passiven Ausscheidung über vier Wochen p. i. wurden drei verschiedene fäkale Ausscheidungsprofile nachgewiesen: 1. eine kontinuierliche, 2. eine intermittierende und 3. eine während der Versuchsdauer sistierende MAP-Ausscheidung mit dem Kot. Die Inokulation führte zu einer schnellen IFN-y-Reaktion, die ab der zweiten Versuchshälfte sank. Die Antikörperproduktion stieg nur wenig später an und verlief parallel zur IFN-y-Reaktion. Drei Tiere bildeten keine Antikörper. Die immunologischen Reaktionen waren durch große individuelle Schwankungen gekennzeichnet. Bei einer Ziege war retrospektiv keine Infektion aber eine IFN-y- und Antikörperreaktion nachweisbar. Tiere mit schweren Läsionen schieden mehr Erreger aus und wiesen in der zweiten Versuchshälfte eine deutlich stärkere Antikörperreaktion auf. Während sich dies als Trend auch für die Intensität der IFN-y-Reaktion nachweisen ließ, unterschied sich ihr Verlauf nicht in Abhängigkeit von der Schwere der pathohistologischen Läsionen. In den ersten 28 Versuchswochen trat unabhängig von der Inokulation eine altersbedingte IL-10-Induktion auf. Im Anschluss unterschied sich die sekretierte Menge IL-10 nicht zwischen Versuchs- und Kontrolltieren. Selbst die Neutralisation dieser geringen IL-10-Mengen in Zellkulturüberständen bewirkte eine Steigerung der IFN-y-Konzentration im IFN-y-Assay. Die vier untersuchten rekombinanten MAP-Proteine induzierten keine spezifische IFN-y-Reaktion, aufgrund einer Kontamination mit LPS jedoch unspezifisch IL-10. Die Genexpression zwischen infizierten und nicht infizierten Ziegen unterschied sich nur für IFN-y signifikant. Ein eindeutig für die Paratuberkulose spezifisches Zytokinmuster war nicht nachweisbar. Das etablierte Infektionsmodell erwies sich als geeignet pathogenetische Fragestellungen zu beantworten und Diagnostika zu entwickeln und zu evaluieren. Für die Untersuchung pathologischer Fragestellungen, die Feldinfektionen imitieren sollen, sollte die Inokulation ab dem 42. Lebenstag bevorzugt werden. Inokulationsdosen, die sich maximal um den Faktor zwei unterscheiden, reichten nicht aus, um Unterschiede in der Immunreaktion darzustellen. Hohe Infektionsdosen führten zu einer schnellen IFN-y- und Antikörperreaktion. IL-10 hat unter diesen Inokulationsbedingungen keinen Einfluss auf den Übergang von zellulärer zu humoraler Immunantwort. Die Schwere der Läsionen war abhängig von der Stärke der Immunantwort und stand in Relation zur Intensität der Ausscheidung. Aufgrund der parallelen Ausscheidung, Antikörperreaktion und IFN-y-Reaktion ist das „klassische“ Modell der Immunreaktion nicht mehr aufrecht zu erhalten, da es lediglich auf einen Teil infizierter Tiere zutrifft. Es muss in Abhängigkeit von der aufgenommenen Erregermenge von einer individuellen Immunreaktion ausgegangen werden. Eine Überwindung der Infektion ist in Betracht zu ziehen. Die untersuchten rekombinanten MAP-Proteine eigneten sich nicht für den Einsatz im IFN-y-Assay. Der Einsatz IL-10-neutralisierender Antikörper ist zur Sensitivitätserhöhung des Tests empfehlenswert. Der Einsatz des IFN-y-Tests unter Feldbedingungen ist derzeit nicht möglich, da sowohl ein Grenzwert als auch ein Altersfenster für die Beprobung aufgrund der großen Schwankungen in der Immunreaktion nicht angegeben werden können. Weiterhin ist unklar, ob eine frühe IFN-y-Reaktion in Zusammenhang mit einer Überwindung der Infektion steht. Die Diagnostik infizierter Tiere anhand von spezifischen Zykotinmustern ist derzeit nicht möglich.