Molekulare Mechanismen der primären Umhüllung von Herpesviren

Alemán. Herpesviren nutzen zwei unterschiedliche Zellkompartimente für die Morphogenese. Während der Kapsid-Zusammenbau und die DNA Verpackung im Zellkern stattfinden, erfolgt die weitere Assemblierung im Zytoplasma. Um dorthin zu gelangen muss die Kernmembranbarriere überwunden werden. Hierfür knospen die Nukleokapside an der inneren Kernmembran und erhalten dort eine primäre Virushülle, die allerdings nach Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren geht. Für diesen als envelopment-deenvelopment bezeichneten Vorgang ist ein Komplex aus zwei viralen Proteinen notwendig. Er besteht aus pUL34, einem Membranprotein der Kernmembran und dessen Interaktionspartner pUL31. Beide Proteine allein reichen aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschnüren. Ziel dieser Arbeit war, diesen nuclear egress weiter zu charakterisieren. Hierfür sollte zunächst geklärt werden, welche Domänen von pUL34 für dessen korrekte Lokalisierung in der Kernmembran und der Interaktion mit dem Komplexpartner pUL31 notwendig sind. Dazu wurden chimäre Proteine aus Teilen des pUL34 und zellulären Proteinen der inneren Kernmembran hergestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die pUL34-Transmembrandomäne keine virusspezifische Funktion besitzt und durch entsprechende Bereiche zellulärer Proteine ausgetauscht werden kann. Auch die Erweiterung der Substitution auf 50 C-terminale Aminosäuren führte zu einem funktionellen Protein, während ein Konstrukt mit einem Austausch von 100 C-terminalen Aminosäuren durch entsprechende Lap2ß Sequenzen den Defekt der PrV-deltaUL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementieren konnte. Dennoch war noch immer eine Interaktion mit dem Komplexpartner möglich. Dies zeigte, dass zwischen den C-terminalen Aminosäuren 50 und 100 ein virusspezifischer, funktionell wichtiger Bereich liegt, der in nachfolgenden Arbeiten weiter eingegrenzt werden muss. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 1-162 des PrV pUL34 für die Interaktion mit pUL31 ausreichen. Für das engverwandte HSV-1 konnte dieser Bereich jedoch auf die Aminosäuren 137 und 181 eingegrenzt werden. Um dies für PrV pUL34 näher zu untersuchen wurde das Konstrukt pUL34-LapNT hergestellt, bei dem die 100 N-terminalen Aminosäuren durch Lap2ß Sequenzen ersetzt wurden. Hier zeigte sich jedoch, dass pUL34-LapNT das pUL31 nicht mehr an die innere Kernmembran rekrutieren konnte und folglich den Defekt der PrV-delta UL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementierte. Im Gegensatz zu HSV-1 scheinen hier auch die N-terminalen 100 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 notwendig zu sein. Da die Expression von pUL34 und pUL31 allein ausreicht, um die Bildung von Membranvesikeln von der inneren Kernmembran abzuschnüren, sollte im Weiteren getestet werden, ob auch Kapside in diese Vesikel aufgenommen werden. Da bei Herpesviren die Kapside autokatalytisch gebildet werden und dies bereits für einige Herpesviren über Expression in rekombinanten Baculoviren nachgestellt werden konnte, sollte versucht werden, dies auch für PrV zu etablieren. Dabei sollte die Kapsidbildung über Transduktion in Säugerzellen unabhängig von einer PrV Infektion nachgestellt werden. Hierbei sollte geklärt werden, welche weiteren viralen Proteine, neben den eigentlichen Kapsidproteinen, wie z.B. das pUL17 und pUL25, für den nuclear egress notwendig sind. Obwohl alle Kapsidkomponenten kloniert und auch in Zellen exprimiert werden konnten, konnte keine Kapsidbildung nachgewiesen werden. Die Ursachen hierfür konnten nicht geklärt werden. Auffällig war, dass das Triplexprotein pUL38 in den Baculovirus-transduzierten Zelllysaten ein etwas anderes Laufverhalten als das in Zelllysaten PrV-infizierter Zellen aufwies, dessen Ursache nicht auf der Verwendung eines downstream lokalisierten Startkodons beruhte. Mit Hilfe dieser rekombinanten Baculovirusvektoren konnte jedoch gezeigt werden, dass das Hauptkapsidprotein pUL19 mit dem Gerüstprotein (pUL26 bzw. pUL26.5) und die Triplexproteine pUL18 und pUL38 gemeinsam in den Kern transportiert werden. Die Beteiligung zellulärer Proteine am nuclear egress sollte über siRNA Experimente untersucht werden. In einer vorangegangen Arbeit war gezeigt worden, dass p97, eine zelluläre AAA+ATPase, nach Infektion vermehrt exprimiert wurde. Ziel war es, die p97 Expression über siRNA zu reduzieren und den Effekt auf die Virusinfektion zu untersuchen. Eine erfolgreiche siRNA Studie war bereits für p97 in Rattenzellen publiziert und sollte hier angewandt werden. Leider waren die zur Verfügung stehenden Rattenzelllinien nur sehr ineffizient transfizierbar und zusätzlich auch schlecht mit PrV infizierbar. Das eigene Design und die Anwendung von p97 spezifischer siRNA für Kaninchenzellen zeigte zwar die gewünschte Reduktion der p97 Expression, war jedoch nur sehr schlecht reproduzierbar und konnte daher nicht für aussagekräftige Infektionsversuche verwendet werden.

Inglés. Capsid assembly in the nucleus and subsequent nuclear egress represent essential steps for virion morphogenesis during the herpesvirus replication cycle. Assembly of viral capsids is an autocatalytical process. After DNA packaging, mature capsids have to cross the nulear membranes in order to gain access to the cytosol where virus morphogenesis resumes. Therefore, viral capsids bud at the inner nuclear membrane thereby gaining a primary envelope. The nuclear egress complex (NEC) comprising the viral proteins pUL31 and pUL34 is essential for this process. Both proteins are sufficient for forming primary envelopes at the inner nuclear membrane. Release of nucleocapsids from the perinuclear space occurs after fusion of the primary envelope with the outer nuclear membrane. This process is supposed to be dependent on cellular proteins. For further investigation of the nuclear egress pathway of PrV nucleocapsids this study focused on virus-specific functional domains of pUL34. Therefore, chimeric proteins consisting of different parts of pUL34 fused to corresponding regions of cellular inner nuclear membrane proteins were constructed and functionally characterized. The results showed that amino acids 212 to 262 of pUL34 including the transmembrane domain could be functionally substituted by the corresponding region of the inner nuclear membrane protein Lap2ß while extension of the substituted domain up to amino acid 161 resulted in a non functional protein despite continuing interaction with pUL31. These results showed that pUL34 exerts another, yet unknown, essential function besides anchoring pUL31 at the inner nuclear membrane. Further studies on pUL34 showed that sequences within the first 100 amino acids are necessary for interaction with pUL31 which is in contrast to results shown for HSV-1 pUL34. Neither recruitment of pUL31 nor complementation of PrV-deltaUL34 could be observed in pUL34-LapNT. Expression of pUL34/pUL31 alone results in formation of primary envelope-like structures at the inner nuclear membrane. Therefore the second aim was to test whether capsids could be incorporated into these vesicles. The autocatalytical process of capsid assembly has already been shown for other herpesviruses by expression of all essential capsid proteins by recombinant baculoviruses. “In vitro” capsid assembly in the absence of herpesvirus infection should be established for PrV including subsequent testing additional requirements for their nuclear egress in pUL31/pUL34 expressing cells. Although all capsid proteins could be expressed in mammalian cells no capsid assembly could be observed. The reason for this is unclear at present. Interestingly, baculovirus-expressed pUL38 showed differences in size compared to pUL38 of PrV infected cells. The reason for this could not be ascribed to the usage of a second downstream located startcodon. However, coexpression of pUL19 with scaffold (pUL26/pUL26.5) and pUL18 with pUL38 resulted in efficient nuclear localization confirming results shown for HSV-1. The third approach aimed at identification of cellular proteins involved in the release of capsids. In a previous study the AAA+ATPase p97 was shown to be differentially regulated after PrV infection. Here in this study expression p97 should be specifically blocked by using RNA interference and effects on PrV replication should be studied. Using published shRNA to reduce p97 levels on rat cell lines was unsuccessful. Reasons for that might be the low transfection effiency and cytotoxic effects of the used transfection reagent. The in-house design and application of p97 specific siRNA on rabbit cell lines resulted in a reduction of p97 expression but this downregulation was only poorly reproducible. Therefore the role p97 plays during virus replication remains unknown.