Validierung Mandel-spezifischer Real-time PCR-Systeme und Herstellung von Plasmidstandards als Referenzmaterial zum Allergennachweis

Alemán. Geringste Spuren von Allergenen in verarbeiteten Lebensmitteln stellen eineGesundheitsgefahrdung fur den betroffenen Personenkreis dar. Die Vermeidung bzw.Verminderung des Eintrags von Allergenen in Lebensmitteln stellt demzufolge dasentscheidende Ziel der Hersteller, deren luckenlose Detektion die Aufgabe derLebensmitteluberwachungsamter dar.Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden drei Real-time PCR-Systeme zum Nachweisvon Mandel hinsichtlich der Optimierung der Primerkonzentration, der Bestimmung derEffizienz, des Limit of Detection, der Spezifitat und der Wiederholbarkeit validiert undbewertet. Dabei wurde besonderer Wert auf die Spezifitatstestung gelegt. Zwei dervalidierten Systeme (Leidinger, Holzhauser) wurden daraufhin fur die Herstellung vonPlasmiden eingesetzt. Die Plasmide dienten in der vorliegenden Arbeit zurQuantifizierung von Mandel-DNA. Die praktische Anwendbarkeit des fur den Mandel-Nachweis auf Basis der Validierungsdaten ausgewahlten Real-time PCR-Systems wurdeanhand von dotierten Wurstproben und Schokoladen aus dem Handel demonstriert. Inden dotierten Wurstproben wurden zuverlassig Gehalte von 10 ppm Mandelnachgewiesen. In kommerziell erhaltlichen Schokoladen konnten Spuren von Mandel-DNA in zwei Proben sicher detektiert und mit Hilfe der hergestellten Plasmidequantifiziert werden.Die Anwendung der PCR ist aufgrund ihrer Vorteile (hoher Probendurchsatz, relativgeringer apparativer Aufwand, schnelle Durchfuhrung) eine bedeutende Methode imBereich der Allergenanalytik. Der Anspruch der grostmoglichen analytischen Sicherheitund damit der Sicherheit des Verbrauchers ist durch die Anwendung einer einzelnen,zudem indirekten Methode jedoch wissenschaftlich nicht begrundbar. PositiveErgebnisse mussen uber protein-basierende Methoden bestatigt werden, wahrendnegative Ergebnisse die Anwesenheit von allergenen Spezies ausschliesen und somit dieAnzahl von Bestatigungstestungen (z.B. ELISA) reduzieren.Die favorisierten Methoden zum Mandel-DNA Nachweis konnen Eingang in Screening-Verfahren finden, da die Ergebnisse der umfassenden Validierung in dieser Arbeitvorliegen. Des Weiteren wurde die Leistungsfahigkeit des Plasmids uberpruft und diePraxistauglichkeit eines Real-time PCR-Systems unter Verwendung des internenReferenzmaterials anhand verschiedener Lebensmittelmatrices getestet.