Entwicklung und Validierung von mollusken-spezifischen Real-Time PCR Systemen zur Detektion von Allergenen in Lebensmitteln

Alemán. Betrachtet man die Prävalenzen einer Meerestierallergie von 2% aller Erwachsenen, scheint die Gesamtproblematik der Molluskenallergie im Vergleich zu anderen Nahrungsmittelallergenen unbedeutend. Wird jedoch beachtet, dass 20% der Meerestierallergiefälle auf Weichtiere zurückzuführen sind und eine Sensibilisierung durch aerogene Allergene wie die der Hausstaubmilbe erfolgen kann, wird die Bedeutsamkeit der Weichtierallergie deutlich. Erst seit dem Jahre 2007 wurden die Mollusken - nach einer Bewertung durch die European Food Safety Authority (EFSA) - in die Liste der deklarierungspflichtigen Hauptallergenträger aufgenommen. Die bestehende Rechtslage der Deklaration der Allergene und die Wahrung der Verbraucherinteressen folgern in der Notwendigkeit eines Nachweisverfahrens von Mollusken.Für die Etablierung eines RT-PCR Verfahrens zur Detektion verschiedener Molluskenspezies, wurden zunächst in silico Analysen durchgeführt mit dem Ziel ein Markergen ausfindig zu machen, welches zwischen verschiedenen Molluskenspezies Konsensubereiche aufweist. Dieser Ansatz musste aufgrund zu weniger Homologien und mangelnder Positivkontrollen fallen gelassen werden. Der Einsatz eines Literatursystems von Merritt et al . führte zur Amplifkation eines polymorphen Cytochrom B Bereiches in verschiedenen Molluskenspezies. Nach der Sequenzierung dieser entstandenen Amplifikate wurden aufgrund mangelnder Homologien zunächst speziesspezifische RT-PCR Systeme für Jakobsmuschel, Meeresschnecke, Tintenfisch und Miesmuschel entwickelt. Die etablierten Primersysteme wurden in einer klassischen PCR getestet. Aufgrund unterschiedlicher Widrigkeiten konnten nur das Tintenfisch- und Miesmuschel-System zur Vervielfältigung des gewünschten Cyt B führen. Das tintenfischspezifische RT-PCR System konnte nicht nach den einheitlichen Parametern validiert werden, da es nicht möglich war reproduzierbar amplizierbare DNA zu extrahieren. Eine Vielzahl an unterschiedlichen Versuchen zur Optimierung der PCR mit tintenfischspezifischen Primern legt den Schluss nahe, dass proteinbasierte Methoden in der Diagnostik von Tintenfisch die geeignete Vorgehensweise darstellen. Ferner waren der Vergleich und die Optimierung von vier verschiedenen DNA-Extraktionsmethoden zentraler Bestandteil dieser wissenschaftlichen Arbeit.Das etablierte RT-PCR Miesmuschelsystem wurde nach einem einheitlichen Schema hinsichtlich der Primerkonzentration, der Effizienz, des LOD und der Spezifität der Primer validiert. Das entwickelte System erlaubt nicht nur der Nachweis verschiedener Miesmuschelspezies, sondern auch den parallelen Nachweis von Jakobsmuschel, Oktopus, Auster, Tintenfisch und Weinbergschnecke. Mit der vorliegenden Diplomarbeit konnte ein erster Schritt zum Nachweis von Molluskenspezies gemacht werden. Um die Praxistauglichkeit des validierten RT-PCR Systems zum Nachweis von Mollusken aus Lebensmittelmatrices festzustellen, ist die Aufgabe für zukünftige Forschung dotiertes Referenzmaterial und Handelsproben zu untersuchen.