Utilización del gen 18s, como marcador genético para la identificación molecular de diatomeas epilíticas

The diatomaceous communities are present in all aquatic systems, being highly sensitive to any change in the ecological status, in particular to the concentration of nutrients. That is why they are used as bio indicators of water quality. To do this, morphological identifications have been made that require great microscopic skill and the use of taxonomic guides. To reduce the complexity of identification, molecular tools based on genetic barcodes have been implemented that help complement the biomonitoring of water bodies, the greatest limitation for their use being the lack of epithelial diatoms sequences in Ecuador to practice on. The task presented was based on evaluating the potential use of the 18SV4 gene as a DNA barcode in the epilithic diatoms of Ecuador, evaluating and verifying its ability to differentiate between species and the feasibility of using universal primers. For this it was necessary to analyze the sequences deposited in the NCBI of epilithic diatoms of different origins, by analyzing their alignment using the UNIPROGEN program, which determined the regions that presented interspecific variability, and the flanking zones that allow their amplification in all species. Diatomaceous cultures were established in the CHU # 10 culture medium, in order to perform the molecular analyzes, DNA extraction and PCR amplification. A pure culture could not be obtained, so the work was carried out with a mixed culture of green algae and diatoms in which four species of diatoms were observed under a microscope, which were then identified with the use of taxonomic guides. The DNA of the specific culture was extracted by two methods: The process using the Powersoil DNA isolation kit and the extraction buffer method. The conditions were established for the amplification by PCR and finally a DGGE was made that allowed the separation of the DNA bands of 3 of the 4 species present in the crop: Gomphonema langenula, Gomphonema parvulum, Navicula cataracta-rheni and Nitzchia acidoclinata

Las comunidades de diatomeas se encuentran presentes en todos los sistemas acuáticos siendo altamente sensibles a cualquier cambio en el estado ecológico, en particular a la concentración de los nutrientes, es por esta razón que son usadas como bioindicadores de la calidad de agua. Para ello, se han realizado identificaciones morfológicas que requieren de gran habilidad microscópica y el uso de guías taxonómicas. Para reducir la complejidad de identificación se han implementado herramientas moleculares basadas en códigos de barras genético que ayudan a complementar el biomonitoreo de los cuerpos de agua, siendo el mayor limitante para su uso la falta de secuencias de diatomeas epilíticas en el Ecuador. El presente trabajo estuvo enmarcado en evaluar el uso potencial del gen 18SV4 como código de barras de ADN en diatomeas epilíticas del Ecuador, evaluando y comprobando su capacidad de discriminación entre las especies y la factibilidad de usar cebadores universales. Para ello fue necesario analizar las secuencias depositadas en el NCBI, de diatomeas epilíticas de diferentes orígenes, por medio de su alineamiento usando el programa UNIPROGEN determinando la región que presenta variabilidad interespecifica, y las zonas flanqueantes que permiten su amplificación en todas las especies. Se establecieron cultivos de diatomeas en el medio de cultivo CHU # 10, para poder realizar los análisis moleculares, extracción de ADN y amplificación por PCR. No se pudo obtener un cultivo puro por lo que el trabajo se realizó con un cultivo mixto de algas verdes y diatomeas en el que se observaron por microscopia cuatro especies de diatomeas, que fueron identificadas con el uso de guías taxonómicas. Se extrajo el ADN del cultivo por dos métodos: Protocolo de Kit de aislamiento de ADN Power Soil y el Protocolo de extracción buffer, se establecieron las condiciones para la amplificación por PCR y finalmente se realizó una DGGE que permitió separar las bandas de ADN de 3 de las 4 especies presentes en el cultivo: Gomphonema langenula, Gomphonema parvulum, Navicula cataracta-rheni y Nitzchia acidoclinata