PL: Poszukiwanie epitopów limfocytów T regulatorowych (Tregitopów) u psów jako czynników immunomodulujących o potencjalnych właściwościach terapeutycznych | EN: Searching for epitopes of regulatory T lymphocytes (Tregitopes) in dogs as immunomodulatory factors with potential therapeutic properties

abstractPL: Limfocyty T posiadające receptor TCR αβ + i chrakteryzujące się fenotypem CD4 + FOXP3 + są subpopulacją limfocytów określanych jako limfocyty T regulatorowe (Treg). Ich funkcja i fenotypowe właściwości najlepiej zostały poznane u myszy i u człowieka. Pełnią one szereg funkcji immunomodulujących uczestnicząc w zachowaniu homeostazy układu odpornościowego. U zwierząt towarzyszących i gospodarskich również występują limfocyty Treg. Jednak pełne dane co do ich frekwencji w ogólnej puli limfocytów oraz dokładne mechanizmy działania są zdecydowanie gorzej poznane niż w przypadku ludzi i modeli mysich i nadal są przedmiotem badań. Epitopy limfocytów T regulatorowych (tzw. tregitopy) są definiowane jako sekwencje peptydowe znajdujące się we fragmencie Fc przeciwciał klasy IgG, rozpoznawane w kontekście MHC kl. II przez limfocyty T regulatorowe. Uwzględniając obecny stan wiedzy za cel pracy obrano określenie wpływu cząsteczek IgG oraz tregitopu (EEQ) i peptydów o potencjalnych właściwościach tregitopów (EQF i PSV) na frekwencję limfocytów Treg w hodowli in vitro limfocytów psów jako potencjalnych immunomodulatorów. Do badań wykorzystano krew pełną psów rasy beagle. Wszystkie osobniki były klinicznie zdrowe. Łącznie pobrano krew od 15 osobników. W badaniach wykorzystano izolację i hodowlę jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC). Komórki PBMC poddawano stymulacji i określano wielkość populacji limfocytów CD4 wykazujących obecność antygenów FOXP3 i CD25. Wykonano trzy warianty doświadczenia, gdzie w pierwszym do stymulacji komórek użyto frakcję IgG psa, peptyd PSV i tregitop EEQ. W drugim wariancie komórki stymulowano tregitopem EEQ, peptydem EQF i PSV. W trzecim, w celu sprawdzenia czy odpowiedź przypominająca na antygeny szczepionkowe może zmieniać odpowiedź limfocytów Treg wykorzystano kostymulację tregitopów EEQ i PSV z inaktywowanymi wirusami nosówki i parwowirozy psów. Czas trwania hodowli wynosił 5 dni dla wariantu pierwszego i 7 dni dla pozostałych wariantów. Po zakończonej hodowli frekwencję komórek z ekspresją badanych antygenów analizowano metodą cytometrii przepływowej. W wyniku przeprowadzonego doświadczenia zaobserwowano: w hodowli 5 dniowej istotne statystycznie spadki frekwencji komórek CD4+CD25+ po stymulacji IgG i EEQ, komórek CD25+FOXP3- po stymulacji IgG i EEQ; istotnie statystycznie wzrosty frekwencji CD4+FOXP3+, CD25+FOXP3+, CD25-FOXP3+ po stymulacji IgG i PSV; w hodowli 7 dniowej zaobserwowano istotne statystycznie spadek frekwencji: komórek CD4+CD25+ dla EEQ, istotnie statystycznie wzrosty frekwencji komórek CD4+FOXP3+ dla EQF i PSV. Dodatkowo zaobserwowano, że wykorzystana metoda hodowli in vitro Treg pozwala na hodowlę 7 dniową ze średnią żywotnością komórek 97%, a dodatek rekombinowanej psiej IL-2 zapewnia właściwe warunki do hodowli limfocytów Treg. Kostymulacja antygenami szczepionkowymi nie spowodowała istotnie statystycznego wzrostu frekwencji komórek regulatorowych, natomiast zaobserwowano, odmiennie jak w przypadku stymulacji samymi peptydami, spadek frekwencji limfocytów CD4+CD25+ niezależnie od jednoczesnej ekspresji czynnika transkrypcyjnego FOXP3. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń stwierdzono, że w przeciwieństwie do ludzkiego tregitopu EEQ, użyte w doświadczeniu psie peptydy o potencjalnych właściwościach tregitopów wpływają na wzrost populacji limfocytów Treg.

abstractEN: T regularatory lymphocytes (Treg) are cells with CD4 + FOXP3 + phenotype. These cells are subpopulation of CD4 + cells with TCR αβ + receptor. The major function of Tregs is maintenance of steady state of animals’ immune system. Farm animals as well as pets have Tregs but knowledge about them is still less known than in mice or human. Tregitopes are epitopes of T regulatory lymphocytes. These epitopes are peptide sequences in Fc fragment of immunoglobulin G, which are recognized by MHC II. The goal of PhD study was evaluating stimulation of Treg with IgG and tregitopes as potential immunomodulator in autoimmune disease treatment. During experiment, whole blood form 15 beagle dogs were collected. All animals were clinically healthy. PBMC were used to start in vitro cell culture. We performed 3 experiments. First experiment cells were stimulated with addition IgG, PSV tregitope and EEQ tregitope. Second experiment we replaced IgG with EQF. Third experiment where cells were stimulated with addition EEQ tregitope or PSV tregitope and mixture of inactivated Canine Diastemper Virus and Canine Parvovirus. Cell culture duration time was 5 days (first experiment) and 7 days (second, third experiment). After cell culture, PBMC was stained with CD4, CD25, FOXP3 fluorescence markers. To analysis flow cytometry was used. As a result of the experiment, the following were observed: in a 5-day culture, statistically significant decreases in the frequency of CD4+CD25+ cells after IgG and EEQ stimulation, CD25+FOXP3- cells after IgG and EEQ stimulation; statistically significant increases in CD4+FOXP3+, CD25+FOXP3+, CD25-FOXP3+ frequency after IgG and PSV stimulation; in a 7-day culture, a statistically significant decrease in the frequency of CD4+CD25+ cells for EEQ was observed, statistically significant increases in the frequency of CD4+FOXP3+ cells for EQF and PSV. Costimulation with vaccine antigens did not result in a statistically significant increase in the frequency of regulatory cells, while a decrease in the frequency of CD4+CD25+ lymphocytes was observed independent of the simultaneous expression of the transcription factor FOXP3. As a result of the experiments, it was concluded that in contrast to human tregitope EEQ, the canine peptides with potential tregitope properties used in the experiment, affect the population of Treg lymphocytes. Additionally, it was observed that the in vitro Treg culture method used allows for a 7-day culture with an average cell viability of 97%, and the addition of recombinant canine IL-2 provides the appropriate conditions for Treg lymphocyte culture.

status: finished

collation: 61