Estudo da distribuição de genes relacionados a efeitos probióticos e avaliação do potencial bacteriocinogênico em Lacticaseibacillus rhamnosus

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2024.

A bactéria Gram-positiva Lacticaseibacillus rhamnosus tem sido amplamente estudada quanto aos seus efeitos benéficos para a saúde humana. Apesar disso, é consenso na literatura científica que os efeitos probióticos são cepa-dependentes, o que impede generalizações dos efeitos para espécies, particularmente àquelas com grande diversidade genômica. Poucas moléculas foram classificadas como efetoras probióticas, dentre essas, as adesinas e as bacteriocinas são duas classes de moléculas consideradas capazes de exercer efeitos probióticos. Uma vez que a diversidade genômica pode promover especializações de nicho em uma população bacteriana, criando filogrupos correlacionados e considerando a abundância de relatos e genomas disponíveis de cepas probióticas de L. rhamnosus, este trabalho investigou todos os genomas disponíveis publicamente dos gêneros Lactobacillus e Lacticaseibacillus para estudar o pan-genoma e a estrutura de população de L. rhamnosus e mapear a distribuição de adesinas e bacteriocinas nos genomas desta espécie. Oito filogrupos, PG1 a PG8, foram detectados na população de L. rhamnosus, constituída por 178 genomas. A espécie possui um pan-genoma aberto; PG1, PG3, PG4, e PG5 exibiram alta conservação gênica, ao passo que os outros filogrupos são mais heterogêneos. O operon de adesinas spaCBA-srtC1 foi encontrado em 44 (24,7%) dos genomas; contudo, considerando somente o PG1, a prevalência foi de 65%. No PG2 a prevalência de spaCBA-srtC1 foi de 43%. Tanto isolados da microbiota humana, quanto derivados de laticínios apresentaram o operon spaCBA-srtC1. Enquanto, que a distribuição do operon spaCBA-srtC1 é esparsa, spaFED-srtC2 é comum a todos os genomas de L. rhamnosus. Adicionalmente, dois principais tipos de clusters de genes de bacteriocinas foram encontrados (Bact1 e Bact2). O cluster Bact1 é composto pelo gene garQ, que codifica uma bacteriocina de classe II - Garvieacina Q e uma proteína de imunidade. Bact1 está majoritariamente presente nos filogrupos PG8A e PG2. O filogrupo PG2 possui duas populações distintas, contendo ou spaCBA-srtC1 ou Bact1. Na segunda etapa deste estudo, com aquisição da cepa L. rhamnosus HN001 (PG2), a classificação taxonômica desta cepa foi confirmada, bem como a presença do operon garQI, o qual foi submetido à amplificação. O sequenciamento do amplicon garQI e sua posterior análise confirmou que o fragmento se trata da região garQI. Análises in silico revelaram que tanto L. rhamnosus HN001 quanto as demais doze cepas possuidoras de garQI possuem os genes garCD, que participam da síntese de proteínas de transporte e processamento da bacteriocina GarQ. Entretanto, os testes de inibição in vitro não foram eficazes em revelar efeitos inibitórios do sobrenadante de cultivo sobre as cepas indicadoras Listeria monocytogenes Scott A e E. coli ATCC 25922. Nossos resultados constituem novas evidências na distribuição de genes de relevância biotecnológica na população de L. rhamnosus, revelando padrões intra-espécie que podem auxiliar no desenvolvimento de produtos probióticos mais eficientes, além de constituir a etapa inicial na elucidação dos parâmetros envolvidos na síntese, secreção e atividade de Garvieacina Q por L. rhamnosus HN001.

Abstract: The Gram-positive bacterium Lacticaseibacillus rhamnosus has been widely studied for its beneficial effects on human health. However, it is a consensus in the scientific literature that probiotic effects are strain-dependent, which hinders generalizations of effects to species, especially those with high genomic diversity. Few molecules have been classified as probiotic effectors, among these, adhesins and bacteriocins are two classes of molecules considered capable of exerting probiotic effects. Since genomic diversity can promote niche specializations in a bacterial population, creating correlated phylogroups and considering the abundance of reports and available genomes of L. rhamnosus probiotic strains, this work investigated all publicly available genomes of the genera Lactobacillus and Lacticaseibacillus to study the pan-genome and population structure of L. rhamnosus and map the distribution of adhesins and bacteriocins in the genomes of this species. Eight phylogroups, PG1 to PG8, were detected in the L. rhamnosus population, consisting of 178 genomes. The species has an open pan-genome; PG1, PG3, PG4, and PG5 exhibited high gene conservation, while the other phylogroups are more heterogeneous. The spaCBA-srtC1 adhesin operon was found in 44 (24.7%) of the genomes; however, when considering only PG1, the prevalence was 65%. In PG2, the prevalence of spaCBA-srtC1 was 43%. Both isolates from the human microbiota and those derived from dairy products presented the spaCBA-srtC1 operon. While the distribution of the spaCBA-srtC1 operon is sparse, spaFED-srtC2 is common to all L. rhamnosus genomes. Additionally, two main types of bacteriocin gene clusters were found (Bact1 and Bact2). The Bact1 cluster is composed of the garQ gene, which encodes a class II bacteriocin - Garvicin Q and an immunity protein. Bact1 is predominantly present in phylogroups PG8A and PG2. The PG2 phylogroup has two distinct populations, containing either spaCBA-srtC1 or Bact1. In the second stage of this study, with the acquisition of the L. rhamnosus HN001 strain (PG2), the taxonomic classification of this strain was confirmed, as well as the presence of the garQI operon, which was subjected to amplification. Sequencing of the garQI amplicon and subsequent analysis confirmed that the fragment corresponds to the garQI region. In silico analyzes revealed that both L. rhamnosus HN001 and the other twelve strains possessing garQI have the garCD genes, which are involved in the synthesis of transport and processing proteins of the bacteriocin GarQ. However, in vitro inhibition tests were not effective in revealing inhibitory effects of the culture supernatant on the indicator strains Listeria monocytogenes Scott A and E. coli ATCC 25922. Our results constitute new evidence on the distribution of genes of biotechnological relevance in the L. rhamnosus population, revealing intra-species patterns that can assist in the development of more efficient probiotic products, and constitute the initial step in elucidating the parameters involved in the synthesis, secretion and activity of Garviacin Q by L. rhamnosus HN001.