Expressão da proteína quinase de nicotiana (NPK1) aumenta a tolerância à seca em cana-de-açúcar transgênica

Orientador : Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho

Coorientador : Dr. Douglas Silva Domingues

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Defesa: Curitiba, 27/11/2015

Inclui referências : 22-44;80-91

Área de concentração: Produção vegetal

Resumo: O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), seguido pela Índia e China. A cana é produzida em quase todas as regiões do Brasil e, devido às diferentes condições edafo-climáticas encontradas no país, a cultura está sujeita a estresses ambientais, como o déficit hídrico. Até o momento, o desenvolvimento de variedades melhoradas tem sido a principal estratégia para a produção de materiais tolerantes a ambientes com condições de crescimento sub-ótimas. No entanto, novas ferramentas permitem o estudo e a manipulação da expressão dos genes, possibilitando um melhor entendimento dos mecanismos biológicos, e o consequente uso de plantas geneticamente modificadas com a introdução de genes que confiram tolerância a estresses. Este estudo teve como objetivo o desenvolvimento de plantas de cana-de-açúcar transgênicas mais tolerantes ao déficit hídrico superexpressando o gene NPK1. Este gene foi isolado de plantas de tabaco, sendo ativado na presença dos H2O2 e inicia uma cascata metabólica de proteínas-quinases ativadas por MAPKs. A cascata MAPK funciona em resposta a estresses osmóticos que ocorrem nas plantas em condições extremas de seca. Para tanto, foi utilizado o vetor pSHX004, que é composto pelo domínio catalítico do gene NPK1, sob controle de promotor constitutivo CaMV35S modificado. Foram utilizados os métodos de transformação por bombardeamento de partículas e infecção por Agrobacterium tumefaciens e, para ambos, calos embriogênicos da variedade RB855536 foram selecionados com 5 mg/L de glufosinato de amônio. Plantas de cana-de-açúcar transgênicas potencialmente transformadas geneticamente foram obtidas pelos dois métodos apresentando o fragmento do transgene confirmado por PCR. Foram então selecionados dois eventos transgênicos - um de cada método de transformação - para as análises de tolerância ao estresse hídrico em casa de vegetação. Estes eventos foram submetidos à restrição hídrica por 12 dias e em seguida foram reidratados. As plantas transgênicas apresentaram melhor desempenho, em relação à plantas-testemunha (não transformadas geneticamente) nas análises de relação hídrica nas folhas, a partir do sexto dia de estresse hídrico. Nas análises de assimilação de gás carbônico, condutância estomática e transpiração, as plantas com NPK1 apresentaram melhor desempenho a partir do nono dia, e também apresentaram menor conteúdo de prolina livre no 6o, 9o e 12o dias após a suspensão da irrigação e menor dano celular, medido pelo conteúdo de malondialdeído, após 12o dia de restrição hídrica e na reidratação. Dessa forma, espera-se que essas plantas tenham maior potencial de produtividade em situações comumente observadas em períodos sazonais de seca verificados nas principais regiões produtoras do país. Palavra-chave: Saccharum spp.; estresse abiótico; proteína quinase; MAPK

Abstract: Brazil is the largest producer of sugarcane (Saccharum spp.), followed by India and China. Sugarcane is produced in almost all regions of Brazil and, due to different soil and climatic conditions of the country, the culture is subjected to environmental stresses such as drought. Until now, the development of improved varieties has been the main strategy for the production of materials tolerant to environments with sub-optimal growth conditions. However, new tools enable the study and manipulation of gene expression, providing a better understanding of the biological mechanisms and the use of genetically modified plants by introducing genes that confer stress tolerance. This study aimed to develop transgenic sugarcane plants more tolerant to drought by overexpressing the gene NPK1 of tobacco plants, which is activated in the presence of H2O2 and initiates a metabolic cascade of protein kinases activated by MAPKs. The MAPK cascade operates in response to osmotic stress that occurs in plants under extreme conditions of drought. For this, we used the pSHX004 vector, which contains the catalytic domain of NPK1 gene under control of a modified CaMV35S constitutive promoter. Embryogenic calli of variety RB855536 were transformed with particle bombardment and Agrobacterium tumefaciens and selection was done using 5 mg/L ammonium glufosinate. Putative transgenic sugarcane plants were obtained by the two methods and confirmation of the insertion of the transgene was done by PCR. Two transgenic events obtained by each transformation method were selected for the analysis of tolerance to water deficit under greenhouse conditions. These events were submitted to water restriction for 12 days and then were rehydrated. Transgenic plants performed better compared to non transgenic plants in the analysis of water potential and relative water content (RWC) in the leaves, from the sixth day of water stress. Regarding carbon dioxide assimilation, stomatal conductance and transpiration, plants with NPK1 performed better from the ninth day, and had lower free proline content in the 6th, 9th and 12th days after stopping irrigation and less cell damage, measured by malondialdehyde content, at the end of the experiment. Thus, our data showed that these plants have great potential in situations commonly found in seasonal drought periods observed in the main producing regions. Key words: Saccharum spp., abiotic stress, protein kinase, MAPK