Dual approach related to mitochondrial integrity and mitochondrial enzyme assays to differentiate fresh fish fillets from frozen fish fillets | Double approche liée à l'intégrité de la mitochondrie et au dosage des enzymes mitochondriales afin de différencier les filets de poisson frais des filets de poisson congelés

Inglés. Fish consumption in France has increased by 20% in 20 years, from 19.1 kg/inhabitant/year in 2000 to 23.9 kg/inhabitant/year in 2020. This increase leads to an overexploitation of traditional fishing areas that are no longer sufficient to supply the fresh market. To overcome this supply problem, the share of aquaculture has grown considerably over the last 20 years, from 25.7% to 46%. The exploitation of new fishing areas that are increasingly far from consumption sites is also another alternative to these supply shortages, which increases travel from fishing to consumer. As a consequence, fraudulent practices of selling frozen/ thawed aquatic products in the fresh market often occur. The development of a reliable tool for distinguishing fresh and frozen/thawed products remains a major challenge for the seafood sector. The thesis aimed to explore the use of mitochondria as a marker of freshness and freezing of fish. Mitochondria are mostly present in red muscle tissue. Therefore, our study focused on this tissue for the three fish species studied: sea bass (Dicentrarchus labrax), gilthead sea bream (Sparus aurata) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). We have found that freezing leads to profound structural changes in mitochondria, with an alteration of the outer and inner membranes (visible in electron microscopy). The alteration of mitochondrial membranes contributes to the total loss of mitochondrial potential of isolated mitochondria. This loss of potential was analyzed in flow cytometry using two potential probes: TMRM and Rhodamine 123. The loss of potential was observed on fresh fish fillet on Day 9, which limits the use of the loss of potential as a marker of freezing. Mitochondrial permeabilization by freezing/thawing shock was first studied by measuring the NADH permeability of isolated mitochondria. The level of permeabilization was normalized by comparison to permeabilization by a known channel-forming antibiotic alamethicin. This permeabilization was followed by the spectrophotometric measurement of the rate of consumption of NADH by mitochondria and the activation of oxygen consumption by oxygraphy. Freezing/thawing was shown to lead to NADH permeabilization of mitochondria and activation of enzyme complexes which results in increased oxygen consumption. The results obtained on isolated mitochondria were confirmed on entire muscle fibres, thus allowing to skip the mitochondrial extraction steps. Freezing leads to rupture of mitochondrial membranes and plasma membranes. Muscle fibres from frozen muscle are more permeable to NADH and therefore consume it faster than fresh fibres. A greater stimulation of oxygen consumption by thawed fibers was also observed. Maintaining a certain integrity of mitochondria in red muscle makes it possible to explore mitochondrial functions and use them as a marker for freezing/thawing fish fillets. This work showed that mitochondria isolated or present in the fibers of fresh fillets were sensitive to the action of a permeabilizer. Conversely, mitochondria and fibres isolated from frozen fillets were insensitive to alamethicin. This reflects a high level of alteration of mitochondrial membranes in these products. This technique, which uses red muscle, appears to be effective in discriminating between frozen aquatic products and fresh products. It is necessary to define whether it can be adapted to the white muscle of fish fillets.

Francés. La consommation de poisson en France a augmenté de 20 % en 20 ans, passant de 19,1 kg/hab/an en 2000 à 23,9 kg/hab/an en 2020. Cette hausse se traduit par une surexploitation de zones traditionnelles de pêche qui ne sont plus suffisantes pour alimenter le marché du frais. Pour pallier ce problème d’approvisionnement, la part de l’aquaculture s’est considérablement développée ces 20 dernières années en passant de 25,7 % à 46 %. L’exploitation de nouvelles zones de pêche de plus en plus éloignées des sites de consommation est aussi une autre alternative à ces problèmes d’approvisionnement. Si de nombreux produits aquatiques sont connus pour être commercialisés à l’état décongelé, l’alimentation du marché du frais par des produits décongelés constitue une fraude. La mise au point d’un outil fiable de détection des produits congelés/décongelés reste un enjeu majeur pour la filière des produits de la mer. Elle permettrait de détecter les fraudes, la congélation/décongélation pouvant entraîner des modifications au niveau du produit. La thèse avait pour but d’explorer l’utilisation des mitochondries comme marqueurs de fraîcheur et de décongélation. Les mitochondries sont particulièrement présentes dans le tissu musculaire rouge. C’est pourquoi notre étude s’est concentrée sur ce tissu pour les trois espèces de poissons étudiées : le bar (Dicentrarchus labrax), la daurade royale (Sparus aurata) et la truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss). La congélation va entraîner de profondes modifications structurales des mitochondries, avec une altération des membranes externes et internes (visible en microscopie électronique). L’altération des membranes mitochondriales va participer à la perte totale du potentiel mitochondrial des mitochondries isolées. Cette perte du potentiel a été analysée en cytométrie de flux grâce à deux sondes de potentiel : le TMRM et la Rhodamine 123. La perte de potentiel peut cependant être observée sur du filet de poisson frais à J9, ce qui limite l’utilisation de la perte du potentiel comme marqueur de décongélation. La perméabilisation des mitochondries par le choc congélation/décongélation a été étudiée en mesurant la perméabilité au NADH de mitochondries isolées. Le niveau de perméabilisation a été normalisé en utilisant un perméabilisant : l’alaméthicine. Cette perméabilisation a été suivie par la mesure de la vitesse de consommation du NADH par les mitochondries en spectrophotométrie et l’activation de la consommation de d’oxygène en oxygraphie. La congélation/décongélation conduit à une perméabilisation au NADH des mitochondries et à une activation des complexes enzymatiques qui se traduit par un regain de consommation d’oxygène. Pour s’affranchir des étapes d’extraction des mitochondries, ces résultats ont été confirmés sur fibres musculaires. La congélation entraîne une rupture des membranes mitochondriales et des membranes plasmiques. Les fibres musculaires issues du muscle décongelé sont plus perméables au NADH et le consomment donc plus rapidement que les fibres fraîches. Une stimulation plus importante de la consommation d’oxygène par les fibres décongelées est aussi observée. Le maintien d’une certaine intégrité des mitochondries dans le muscle rouge permet d’explorer les fonctions mitochondriales et de les utiliser comme marqueur de congélation /décongélation des filets de poisson. Ces travaux ont montré que les mitochondries isolées ou présentes dans les fibres de filets frais étaient sensibles à l’action d’un perméabilisant. A l‘inverse, les mitochondries et fibres isolées de filets décongelés étaient insensibles à l’alaméthicine. Ceci traduit un niveau élevé d’altération des membranes mitochondriales dans ces produits. Cette technique, qui utilise le muscle rouge, semble efficace pour discriminer les produits aquatiques décongelés des produits frais. Il reste à définir si celle-ci peut s’adapter au muscle blanc des filets de poisson.