Enzimas lignocelulolíticas da microbiota ruminal de ovinos Morada Nova e seu potencial na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar.

Resumo: Os ruminantes são fontes de microrganismos produtores de enzimas lignocelulolíticas, as quais podem ser utilizadas para diferentes aplicações biotecnológicas, como a degradação da fibra do bagaço de cana-de-açúcar (BCA) para uso alimentar ou para produção de bioetanol. Enzimas mais específicas são obtidas quando o próprio substrato de interesse é utilizado na produção dos microrganismos. Nesse sentido, o presente trabalho direcionou a microbiota ruminal de ovinos Morada Nova para a degradação do BCA objetivando extrair as proteínas aderidas à fibra (PAFs) e caracterizá-las quanto ao potencial de degradação do BCA in natura e pré-tratado com 10, 20, 30, 40 ou 50% de NaOH. O conteúdo ruminal foi obtido via fístula, filtrado, lavado com Solução Salina Tamponada (PBS, pH 7,2 sem Ca2+ e Mg2+) e as PAFs extraídas com ureia 8 mmol.L-1 durante 15 minutos. Após serem filtradas e dialisadas contra água (cut off de 12 kDa) as PAFs foram liofilizadas. A atividade total de celulase foi determinada pelo ensaio do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) em pH 3,99 e papel de filtro. As PAFs mostraram maior atividade enzimática em pH 3,99. O pH 11,71 foi identificado como o de máxima extração de proteína. A temperatura de 50 ºC por 60 minutos manteve a atividade específica de celulase total das PAFs e essas também resistiram ao aquecimento a 100 °C por 60 minutos. Em relação aos substratos, as PAFs apresentaram maior atividade específica para xilanase (7,01 ± 0,19 U.mg-1) seguida por endoglucanase (4,71 ± 1,65 U.mg-1), exoglucanase (2,68 ± 0,42 U.mg-1) e celulase total (0,62 ± 0,05 U.mg-1). Quanto aos substratos BCA in natura e pré-tratado, a atividade enzimática das PAFs aumentou de forma proporcional à concentração de NaOH utilizado no pré-tratamento, ao mesmo tempo em que se observou na fibra melhor solubilização da hemicelulose e lignina, e aumento da cristalinidade. As fibras de BCA in natura e pré-tratada foram utilizadas como matriz cromatográfica e observou-se interação das PAFs com as matrizes, com destaque para as matrizes de BCA pré-tratadas com 20% e 40% NaOH. Em conclusão, as enzimas ruminais de ovinos Morada Nova foram capazes de degradar o BCA, sendo sua eficiência elevada ajustando-se o pH e a temperatura reacional, assim como realizando o pré-tratamento alcalino do BCA. Ainda, a própria fibra de BCA pré-tratada pode ser utilizada para isolar e caracterizar enzimas ruminais lignocelulolíticas. Abstract: Ruminants are sources of microorganisms that produce lignocellulolytic enzymes which in turn can be used for different biotechnological applications, such as in degrading sugarcane bagasse (SCB) fibers for food use or for producing bioethanol. More specific enzymes are obtained when the substrate of interest itself is used in producing the microorganisms. In this sense, the present work directed Morada Nova sheep ruminal microbiota to degrade SCB, aiming at extracting proteins adhered to the fibers (PAFs), characterizing them as to the potential degradation of the in natura SCB and those pretreated with 10, 20, 30, 40 or 50% NaOH. The ruminal content was obtained via fistula, filtered, washed with Phosphate Buffer Saline (pH 7.2 without Ca2+ and Mg2+) and the PAFs were extracted with 8 mmol.L-1 urea for 15 minutes. The PAFs were then lyophilized after filtration and dialysis against water (cut-off of 12 kDa). Total cellulase activity was determined by the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay at pH 3.99 and filter paper. The PAFs showed higher enzymatic activity at pH 3.99. The pH of 11.71 was identified as the maximum protein extraction. A temperature of 50 ºC for 60 minutes maintained the specific activity of PAFs total cellulase and they also resisted heating at 100 °C for 60 minutes. Regarding substrates, PAFs showed higher specific activity for xylanase (7.01 ± 0.19 U.mg-1), followed by endoglucanase (4.71 ± 1.65 U.mg-1), exoglucanase (2.68 ± 0.42 U.mg-1) and total cellulase (0.62 ± 0.05 U.mg-1). For the SCB substrates in natura and pretreated, the enzymatic activity of PAFs increased in proportion to the increased concentration of NaOH used in the pretreatment, while at the same time better hemicellulose and lignin solubilization were observed in the fiber, as well as increased crystallinity. In natura and pretreated SCB fibers were used as a chromatographic matrix and interaction of the PAFs with the matrices was observed, especially the pretreated SCB matrices with 20% and 40% NaOH. In conclusion, Morada Nova sheep ruminal enzymes were able to degrade SCB fibers, with higher efficiency by adjusting the pH and reaction temperature, as well as performing alkaline pretreatment of the SCB. In addition, the pretreated SCB fiber itself can be used to isolate and characterize lignocellulolytic ruminal enzymes.

Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. Orientador: Antônio Sílvio do Egito (Embrapa Caprinos e Ovinos); Coorientadora: Hévila Oliveira Salles (Embrapa Caprinos e Ovinos).