Role of PAR2 and macrophages in hepcidin regulation | Rôle de PAR2 et des macrophages dans la régulation de l'hepcidine

Inglés. Today, it is estimated that about 60% of the body's iron is contained within the hemoglobin molecule, illustrating the essential role of this element in erythropoiesis. In the case of erythroid stress (ES), a condition of anemia that requires the production of new red blood cells, the demand for iron increases. To increase the bioavailability of this iron, the expression of hepcidin, a key hormone in the regulation of iron homeostasis, is inhibited in hepatocytes. However, while the mechanisms of early response to anemia (within 24 hours) are known, those over the longer term remain unclear and suggest the involvement of other cellular and protein actors.Among these actors is the protease-activated receptor 2 (PAR2), encoded by the F2rl1 gene. This protein is activated by various proteases, establishing a link between the environment and the cell in which it is expressed. Our observations on F2rl1 -/- embryos overexpressing hepcidin led us to study PAR2 in an unprecedented pathophysiological context. Thus, the main objective of this thesis was to characterize the role of PAR2 in the regulation of hepcidin. We reveal that, under physiological conditions, PAR2 does not participate in this regulation. However, we demonstrate that in response to ES (induced by two successive phlebotomies), the deletion of PAR2 results in a partial blockage of hepcidin inhibition. Furthermore, the specific deletion of PAR2 in macrophages (F2rl1LysM) recapitulated this phenotype, showing that under specific ES conditions, PAR2 participates in the regulation of hepcidin from its expression in macrophages. Consequently, we explored the involvement of these macrophages in the regulation of hepcidin. Based on a macrophage deletion model, we show that the elimination of these cells induces overexpression of hepcidin and also blocks its inhibition in response to phlebotomy, demonstrating their major role in the regulation of hepcidin. Moreover, based on preliminary in vitro results, we propose that macrophages produce an inhibitor that acts paracrinally on hepatocytes to inhibit hepcidin.In a secondary project, we worked on characterizing the role of hepatocytic matriptase-2 (MT2) in the regulation of hepcidin. MT2 is a transmembrane serine protease mainly expressed in the liver and encoded by the Tmprss6 gene. It negatively regulates the expression of hepcidin. In humans, TMPRSS6 mutations cause iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA), with the same phenotype described in murine models of MT2 deletion.In this context, we evaluated whether the negative regulation of hepcidin by MT2 is exclusively controlled by its hepatocytic localization. For this, mice specifically mutated for MT2 in hepatocytes were developed. We show that these Tmprss6Alb mice present an overexpression of Hamp1 and consequently a decrease in serum and hepatic iron levels, leading to microcytic anemia. We demonstrate that this phenotype is similar to that of total KO mice, confirming the central role of hepatocytic MT2 in the regulation of iron homeostasis.In conclusion, this thesis provides a better understanding of the mechanisms of negative regulation of hepcidin during the late phases of the response to ES, revealing for the first time the contribution of the PAR2 receptor to this mechanism. We also demonstrate the major role of macrophages, which, beyond their involvement in an ES context, also emit inhibitory signals for hepatocytic hepcidin under physiological conditions. Finally, we confirm that the negative regulation of hepcidin by MT2 is entirely controlled by its hepatocytic localization.

Francés. Aujourd’hui, il est estimé qu’environ 60% du fer de l’organisme est complexé au sein de la molécule d’hémoglobine, illustrant le caractère essentiel de cet élément pour l’érythropoïèse. En cas de stress érythroïde (SE), une condition d’anémie qui requiert la production de nouveaux globules rouges, la demande en fer est augmentée. Pour augmenter la biodisponibilité de ce fer, l'expression de l'hepcidine, une hormone clé de la régulation de l'homéostasie martiale, est inhibée dans les hépatocytes. Cependant, bien que les mécanismes de réponse rapide (<24h) soient connus, ceux à plus long terme demeurent flous et suggèrent que d’autres acteurs cellulaires et protéiques pourraient exister.Parmi ces acteurs se trouve le récepteur PAR2 (« protease-activated receptor 2 ») codé par le gène F2rl1. Cette protéine a la particularité d’être activée par diverses protéases, établissant ainsi un lien entre l’environnement et la cellule dans laquelle elle est exprimée. Nos observations sur des embryons F2rl1 -/- surexprimant l'hepcidine nous ont conduits à étudier PAR2 dans un contexte physiopathologique inédit. Ainsi, l’objectif principal de cette thèse a été de caractériser le rôle de PAR2 dans la régulation de l’hepcidine. Nous révélons qu’en condition physiologique, PAR2 ne participe pas à cette régulation. En revanche, nous démontrons qu’en réponse à un SE (induit par deux phlébotomies successives) la délétion de PAR2 engendre un blocage partiel de l’inhibition de l’hepcidine. De plus, la délétion spécifique de PAR2 dans les macrophages (F2rl1LysM) a récapitulé ce phénotype, démontrant que dans des conditions spécifiques de SE, PAR2 participe à la régulation de l’hepcidine depuis son expression dans les macrophages. De ce fait, nous avons exploré l’implication de ces macrophages dans la régulation de l’hepcidine. Basé sur un modèle de délétion des macrophages, nous montrons que l’élimination de ces cellules induit une surexpression de l’hepcidine et bloque également son inhibition en réponse à la phlébotomie, démontrant leur rôle majeur dans la régulation de l’hepcidine. De plus, s’appuyant sur des résultats préliminaires in vitro, nous proposons que les macrophages produisent un inhibiteur qui agit de façon paracrine sur les hépatocytes pour inhiber l’hepcidine.Dans un projet secondaire, nous avons travaillé sur la caractérisation du rôle de la matriptase-2 (MT2) hépatocytaire dans la régulation de l’hepcidine. La MT2 est une protéase à sérine transmembranaire principalement exprimée dans le foie et codée par le gène Tmprss6. Celle-ci régule négativement l'expression de l'hepcidine. Chez l’Homme, des mutations de TMPRSS6 causent une anémie ferriprive appelée IRIDA, le même phénotype est décrit dans des modèles murins de délétion de la MT2. Dans ce contexte, nous avons évalué si la régulation négative de l’hepcidine par la MT2 est exclusivement contrôlée par sa localisation hépatocytaire. Pour cela, des souris spécifiquement mutées pour la MT2 dans les hépatocytes ont été développées. Nous montrons que ces souris Tmprss6Alb présentent une surexpression de Hamp1 et en conséquence une baisse des niveaux de fer sérique et hépatique, entraînant une anémie microcytaire. Nous démontrons alors que ce phénotype est à un degré similaire aux souris KO total, confirmant le rôle central de la MT2 hépatocytaire dans la régulation de l‘homéostasie martiale.En conclusion, cette thèse permet une meilleure compréhension des mécanismes de régulation négative de l’hepcidine lors des phases tardives de la réponse au SE, en révélant de façon inédite la contribution du récepteur PAR2 à ce mécanisme. Nous démontrons également le rôle majeur des macrophages, qui, au-delà de leur implication dans un contexte de SE, émettent aussi des signaux inhibiteurs de l’hepcidine hépatocytaire en conditions physiologiques. Enfin, nous confirmons que la régulation négative de l'hepcidine par la MT2 est entièrement contrôlée par sa localisation hépatocytaire.