Unraveling the physiological functions of LAP1 and the pathological mechanisms underlying LAP1-associated nuclear envelopathies | Estudo das funções fisiológicas da LAP1 e dos mecanismos patológicos subjacentes às envelopatias nucleares associadas à LAP1

Lamina-associated polypeptide 1 (LAP1) is a ubiquitous type II transmembrane protein of the nuclear envelope (NE), whose biological functions remain ill-defined. Though rare, mutations in the human TOR1AIP1 gene resulting in LAP1 depletion cause severe diseases, with clinical manifestations ranging from tissue-restricted pathologies to multisystemic syndromes. The increasing evidence of the pathogenic effects of these mutations hints at critical and multifaceted cellular functions for LAP1, and exploring the pathological consequences of its depletion in human cells could help predicting new physiological functions of LAP1. In this work, LAP1 interaction with telomeric repeat-binding factor 2 (TRF2)—a protein involved in the repair of deoxyribonucleic acid (DNA) damage—was validated in vitro and in human cells exposed to genotoxic treatments, and it was found that such interaction is preferentially established when LAP1 is phosphorylated. The biological relevance of the LAP1:TRF2 complex was pursued and we showed that its formation in cells' nuclei is induced during the DNA damage response (DDR), suggesting a novel regulatory role for LAP1 in this process. To further explore the importance of LAP1 in human physiology, we used patient-derived fibroblasts carrying the pathological LAP1 E482A mutation as a valuable experimental model of LAP1 deficiency. Firstly, we performed their characterization in vitro to assess alterations in NE structure, cytoskeleton organization and unfolded protein response (UPR) signaling activation. In LAP1 E482A fibroblasts, besides altered protein levels of LAP1 interactors (e.g. lamins A and B1; torsinA), we observed abnormal levels and/or subcellular localization of the NE protein Sad1/UNC84 homology domain-containing protein 1 (SUN1) as well as microtubule/actin cytoskeleton proteins. Based on these results, we hypothesize a function for LAP1 in linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex regulation and cytoskeleton dynamics. Afterwards, a mass spectrometry (MS)-based proteomic analysis of LAP1 E482A fibroblasts was carried out to identify differentially expressed proteins, which permitted unveiling possible dysfunctional biological processes through the use of bioinformatics tools and experimental assays. The preliminary findings obtained indicate that LAP1 depletion in human cells induces a deregulation of mechanisms required for DNA repair, messenger ribonucleic acid (RNA) degradation/translation, proteostasis and glutathione metabolism/antioxidant defense. Lastly, a MS-based and in silico methodologies were employed to identify novel LAP1-interacting proteins. The bioinformatic analysis of the biological processes and disease associations of these interactors reinforces the concept that LAP1 may participate in chromatin and cytoskeleton organization, repair of DNA damage, RNA processing, translation and protein folding/degradation. Overall, our results shed light on the physiological importance of human LAP1, could set the basis for future in-depth mechanistic investigations about this NE protein and, hopefully, will be useful for the discovery of therapeutic targets for TOR1AIP1-associated nuclear envelopathies.

A proteína 1 associada com a lâmina (LAP1) é uma proteína transmembranar de tipo II localizada na membrana nuclear (MN) e de expressão ubíqua, cujas funções biológicas permanecem por caraterizar. Embora raras, as mutações no gene humano TOR1AIP1 que resultam na depleção da LAP1 causam doenças graves, com manifestações clínicas que variam desde patologias restritas a alguns tecidos até síndromes multissistémicas. As evidências crescentes dos efeitos patogénicos destas mutações indiciam funções celulares críticas e variadas para a LAP1, pelo que a investigação das consequências patológicas da sua depleção em células humanas pode ser útil no estudo de novas funções fisiológicas da LAP1. Neste trabalho, a interação da LAP1 com a proteína telomeric repeat-binding factor 2 (TRF2)—envolvida na reparação de danos no ácido desoxirribonucleico (ADN)—foi validada in vitro e em células humanas expostas a tratamentos genotóxicos, revelando-se que é preferencialmente estabelecida quando a LAP1 é fosforilada. Explorando a relevância biológica do complexo LAP1:TRF2, verificámos que a sua formação no núcleo das células é induzida durante a resposta a danos no ADN (DDR), sugerindo um novo papel regulador da LAP1 neste processo. Para elucidar a importância da LAP1 na fisiologia humana, utilizámos fibroblastos provenientes de um doente com a mutação patológica LAP1 E482A como modelo experimental de deficiência da LAP1. Inicialmente, efetuámos a sua caraterização in vitro para avaliar alterações na estrutura da MN, organização do citoesqueleto e ativação da resposta a proteínas malconformadas (UPR). Nos fibroblastos LAP1 E482A, para além de níveis alterados de proteínas interatoras da LAP1 (ex: laminas A e B1; torsinaA), observámos níveis e/ou localização subcelular alterados da proteína da MN Sad1/UNC84 homology domain-containing protein 1 (SUN1) e proteínas do citoesqueleto de microtúbulos/actina. Estes resultados propõem uma função para a LAP1 na regulação do complexo linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) e na dinâmica do citoesqueleto. Em seguida, usando espetrometria de massa (EM), analisámos o proteoma dos fibroblastos LAP1 E482A para identificar proteínas diferencialmente expressas, o que permitiu desvendar possíveis processos biológicos disfuncionais recorrendo a ferramentas bioinformáticas e ensaios experimentais. Os dados preliminares obtidos indicam que a depleção da LAP1 em células humanas induz a desregulação de mecanismos de reparação de ADN, degradação/tradução de ácido ribonucleico (ARN) mensageiro, proteostase e metabolismo da glutationa/defesa antioxidante. Por último, identificámos novas proteínas interatoras da LAP1 com recurso a EM e abordagens in silico. A análise bioinformática dos processos biológicos e das associações com doenças destes interatores reforça a ideia de que a LAP1 pode participar na organização da cromatina e citoesqueleto, reparação de danos no ADN, processamento de ARN, tradução e dobragem/degradação de proteínas. Em suma, os nossos resultados evidenciam a importância fisiológica da LAP1 humana, podem estabelecer a base para investigações mecanísticas futuras sobre esta proteína e, idealmente, esperamos que sejam úteis para a descoberta de alvos terapêuticos para doenças associadas a mutações no gene TOR1AIP1.

Programa Doutoral em Biomedicina