Efectos de la domesticación de los rizobios simbiontes de alfalfa, sobre su capacidad de fijar nitrógeno y degradar óxido nitroso

Tesis presentada para optar al título de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2020

La disponibilidad de nitrógeno es un factor crítico para la productividad de los cultivos. La aplicación de fertilizantes nitrogenados sintéticos derivados del petróleo ha logrado disminuir parcialmente la deficiencia de nitrógeno en muchos cultivos. Sin embargo, la producción, la distribución y la aplicación de estos fertilizantes nitrogenados son procesos costosos que producen altas emisiones de gases de efecto invernadero, incluyendo el óxido nitroso (N2O). Una alternativa sustentable para mitigar el uso de fertilizantes nitrogenados es el cultivo de leguminosas capaces de fijar nitrógeno en asociación con bacterias simbiontes en órganos específicos denominados nódulos. Muchas leguminosas, entre las cuales se destacan la alfalfa, no solo son capaces de crecer sin fertilización nitrogenada, sino que además, aportan nitrógeno al suelo. Si bien las leguminosas juegan un papel clave en la sustentabilidad de la agricultura, los nódulos senescentes pueden constituir una fuente vasta de nitrógeno orgánico que derive en altas emisiones de N2O. En esta tesis doctoral, se presentan las bases moleculares que explican la alta emisión de N2O en el cultivo de alfalfa. Específicamente, se encontró que, durante el proceso de domesticación, las cepas utilizadas actualmente para inocular alfalfa a nivel comercial (Sinorhizobium meliloti B399 y Sinorhizobium meliloti B401) conservaron su capacidad de fijar nitrógeno en forma eficiente, pero perdieron su habilidad para degradar el N2O. Esta deficiencia se debe a la deleción del cluster NOS que codifica para el complejo enzimático N2O reductasa (NOS-). Durante la búsqueda de nuevos rizobios naturales amigables con el medio ambiente que contengan el cluster NOS (NOS+), se detectó la presencia de rizobios conteniendo genes de resistencia a antibióticos en plásmidos sintéticos. De esta forma, sería necesario una secuenciación genómica de los rizobios hipotéticamente naturales para garantizar una alta inocuidad ambiental y de salud pública de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Por otra parte, el análisis bioinfomático y experimental de nuevos aislamientos de rizobios, mostró que en la naturaleza surgen mutantes espontáneas del gen napC que combinan alta eficiencia de fijación de nitrógeno con baja emisión de N2O. Además, un subgrupo de estas cepas naturales mostró tener similar eficiencia de fijación de nitrógeno y de nodulación en relación a la cepa comercial B399. De esta forma, los resultados de esta tesis doctoral sugieren que es posible avanzar hacia una producción sustentable de alfalfa, tanto en términos económicos como ecológicos.

The availability of nitrogen is a critical factor for crop productivity. The addition of synthetic nitrogen fertilizers derived from petroleum has partially reduced nitrogen deficiency in many crops. However, the production, distribution and application of these nitrogen fertilizers are costly processes that produce high greenhouse gas emissions, including nitrous oxide (N2O). A sustainable alternative to mitigate the use of nitrogen fertilizers is the cultivation of legumes capable of fixing nitrogen in association with symbiont bacteria in specific organs called nodules. Many legumes, including alfalfa, are not only capable of growing without nitrogen fertilization, but also provide nitrogen to the soil. While legumes play a key role in the sustainability of agriculture, senescent nodules can be a vast source of organic nitrogen that results in high N2O emissions. In this doctoral thesis, the molecular bases that explain the high emission of N2O in alfalfa culture are presented. Specifically, it was found that, during the domestication process, the strains currently used to inoculate alfalfa at the commercial level (Sinorhizobium meliloti B399 and Sinorhizobium meliloti B401) retained their ability to fix nitrogen efficiently, but lost their ability to degrade N2O. This deficiency is due to the deletion of the NOS cluster that codes for the N2O reductase enzyme complex (NOS-). During the screening of new environmentally friendly natural rhizobia containing the NOS cluster (NOS+), the presence of rhizobia containing antibiotic resistance genes in synthetic plasmids was detected. Thus, genomic sequencing of hypothetically natural rhizobia would be necessary to ensure high environmental and public health safety of plant growth promoting bacteria used as commercial inoculants. On the other hand, the bioinfomatic and experimental analysis of new isolates of rhizobia showed that spontaneous mutants of the napC gene arise in nature that combine high nitrogen fixation efficiency with low N2O emission. In addition, a subgroup of these natural strains showed similar nitrogen fixation and nodulation efficiency in relation to commercial strain B399. In this way, the results of this doctoral thesis suggest that it is possible to move towards a sustainable production of alfalfa, both in economic and ecological terms.

Instituto de Genética

Fil: Brambilla, Silvina Maricel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina

Fil: Brambilla, Silvina Maricel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Brambilla, Silvina Maricel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Brambilla, Silvina Maricel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina