Deciphering the function of Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase 1 (MKP1) in plant immune responses and disease resistance

Plants have developed an intricate immune system against pathogenic organisms that is composed of different layers of responses. One of these layers is Pattern Triggering Immunity (PTI) that is activated upon recognition by plant Pattern Recognition Receptors (PRRs) of Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs) or Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs). This recognition initiates signalling pathways through intermediary proteins that amplify the immune signals and disease resistance responses. These proteins, such as BOTRYTIS INDUCED KINASE 1 (BIK1) or MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE PHOSPHATASE 1 (MKP1), are key elements in balancing the activation/repression of PTI events, such as the production of apoplastic reactive oxygen species (ROS), cytoplasmic calcium burst or phosphorylation cascades mediated by mitogen-activated protein kinases and calcium-dependent protein kinases, which lead to transcriptional changes of genes encoding different defensive proteins, such as anti-pathogenic compounds, which determine disease resistance outcome. Arabidopsis thaliana MKP1 negatively balances production of ROS triggered by MAMPs through uncharacterised mechanisms, since ROS production is enhanced in mkp1 mutant after MAMPs treatment. Moreover, mkp1 plants show a constitutive activation of immune responses and enhanced disease resistance to pathogens with distinct colonization styles, like the bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, the oomycete Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2 and the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina BMM. The molecular basis of this ROS production and broad-spectrum disease resistance controlled by MKP1 have not been determined. In this Thesis, we show that the enhanced ROS production in mkp1 is not due to a direct interaction of MKP1 with the NADPH oxidase RBOHD, nor is it the result of the catalytic activity of MKP1 on RBHOD phosphorylation sites targeted by BIK, a positive regulator of ROS production. The analysis of bik1 mkp1 double mutant phenotypes suggested that MKP1 and BIK1 targets are different. Additionally, we showed that phosphorylation residues stabilizing MKP1 are essential for its functionality in immunity. To further decipher the molecular basis of disease resistance responses controlled by MKP1, we generated combinatory lines of mkp1-1 with plants impaired in defensive pathways required for disease resistance to pathogen: cyp79B2 cyp79B3 double mutant defective in synthesis of tryptophan-derived metabolites, NahG transgenic plant that does not accumulate salicylic acid, aba1-6 mutant impaired in abscisic acid (ABA) biosynthesis, and abi1 abi2 hab1 triple mutant impaired in proteins described as ROS sensors and that is hypersensitive to ABA. The analysis of these lines revealed that: mkp1-1 cyp79B2 cyp79B3 fully blocked mkp1-1 resistance to P. cucumerina BMM, whereas mkp1-1 NahG displays partial susceptibility to H. arabidopsidis, and mkp1-1 NahG, mkp1-1 aba1-6 and mkp1-1 cyp79B2 cyp79B3 showed compromised resistance to P. syringae. These results suggest that MKP1 is a component of immune responses that does not directly interact with RBOHD but rather regulates the status of distinct defensive pathways required for disease resistance to pathogens with different lifestyles In this Thesis, we also characterised the function in disease resistance of tomato (Solanum lycopersicum) MKP1 orthologues, SLMKP1A and SlMKP1B. We generated tomato mutants impaired in these genes by using CRISPR_Cas9 genome editing technology and found that these mutants showed enhanced disease resistance to Ralstonia solanacearum and P. syringae in comparison to wild-type plants, further validating MPK1 function as a central negative regulator of multiple layers of plant defence. The broad enhanced resistance phenotypes of mutants defective in MKP1 genes open the possibility to use it as target to generate mkp1 mutant lines with broad-spectrum disease resistance in other crops. RESUMEN Las plantas han desarrollado un intrincado sistema inmunitario contra organismos patógenos que se compone de diferentes capas de respuestas. Una de estas capas es la inmunidad activada por patrones (PTI), que se activa cuando la planta reconoce los patrones moleculares asociados a microbios (MAMP) o los patrones moleculares asociados a daños (DAMP) a través de los receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Este reconocimiento inicia vías de señalización a través de proteínas intermediarias que amplifican la señal inmunitaria y las respuestas de resistencia a las enfermedades. Estas proteínas, como la BOTRYTIS INDUCED KINASE 1 (BIK1) o la MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE PHOSPHATASE 1 (MKP1), son elementos clave para equilibrar la activación/represión de eventos de la PTI, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) apoplásticas, el incremento de calcio citoplasmático o cascadas de fosforilación mediadas por proteínas quinasas activadas por mitógenos y proteínas quinasas dependientes de calcio, que conducen a cambios transcripcionales de genes que codifican diferentes proteínas defensivas, como compuestos antipatógenos, que determinan el resultado de la resistencia a la enfermedad. En Arabidopsis thaliana, MKP1 equilibra negativamente la producción de ROS desencadenada por MAMPs a través de mecanismos no caracterizados, ya que la producción de ROS aumenta en el mutante mkp1 tras el tratamiento con MAMPs. Además, las plantas mkp1 muestran una activación constitutiva de las respuestas inmunes y una mayor resistencia a patógenos con distintos estilos de colonización, como la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, el oomiceto Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2 y el hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina BMM. No se han determinado las bases moleculares de esta producción de ROS y de la resistencia a enfermedades de amplio espectro controladas por MKP1. En esta Tesis, hemos demostrado que el incremento de ROS en mkp1 no se debe a una interacción directa de MKP1 con la NADPH oxidasa RBOHD, ni es el resultado de la actividad catalítica de MKP1 sobre los sitios de fosforilación de RBHOD regulados por BIK1, un regulador positivo de la producción de ROS. Estos resultados sugieren que MKP1 es un componente de las respuestas inmunes que no interactúa directamente con RBOHD, sino que regula el estado de distintas vías defensivas necesarias para la resistencia a patógenos con diferentes estilos de vida. En esta Tesis también se ha caracterizado la función en la resistencia a enfermedades de los ortólogos de MKP1 del tomate (Solanum lycopersicum), SLMKP1A y SlMKP1B. Hemos generado mutantes de tomate alterados en estos genes utilizando la tecnología de edición del genoma CRISPR_Cas9 y hemos observado que estos mutantes muestran una mayor resistencia a la enfermedad de Ralstonia solanacearum y P. syringae en comparación con las plantas de tipo salvaje, validando aún más la función de MPK1 como un regulador negativo central de múltiples capas de defensa de la planta. El amplio fenotipo de resistencia mejorada de los mutantes defectuosos en los genes MKP1 abre la posibilidad de utilizarlo como diana para generar líneas mutantes mkp1 con resistencia a enfermedades de amplio espectro en otros cultivos.