Potencial biotecnológico do leitelho de manteiga e da água de filagem para a produção de ß-galactosidase e ácido lático

Orientadora: Profª. Dra Raquel Ströher

Coorientador: Prof. Dr. Luis Fernando Souza Gomes e Prof. Dr. Dile Pontarolo Stremel

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Defesa : Palotina, 25/02/2025

Inclui referências

Área de concentração: Biotecnologia

Resumo: A água de filagem e o leitelho de manteiga são subprodutos agroindustriais gerados em volumes consideráveis durante a fabricação de manteiga e queijos de massa filada. A possibilidade de aproveitamento desses materiais está relacionada ao elevado valor nutricional de ambos, e além de promover a sustentabilidade ambiental, permite a obtenção de produtos de interesse, como o ácido lático e a ß-galactosidase, insumos essenciais das indústrias alimentícia e farmacêutica. Ambos são comumente obtidos através de fermentação microbiana. Nesse sentido, o estudo teve como objetivo avaliar o potencial biotecnológico da água de filagem e do leitelho de manteiga como substratos para fermentação submersa utilizando uma bactéria da espécie Leuconostoc lactis como inóculo para a produção de ácido lático e ß-galactosidase. Para isso, inicialmente os subprodutos foram avaliados quanto à composição química. Diluições seriadas foram inoculadas em meio Man, Rogosa & Sharpe (MRS) para o isolamento microbiano e o isolado foi identificado através do sequenciamento da região 16S rRNA. Os produtos de interesse foram avaliados como variáveis resposta de um planejamento experimental do tipo fatorial 2³ com quadruplicata no ponto central, tendo como variáveis independentes a composição do substrato (água de filagem e leitelho de manteiga), a temperatura (30 e 40 ºC) e a suplementação com extrato de levedura (2 e 6 %), os frascos foram incubados sob agitação a 150 rpm, por 48 h e as amostras foram retiradas para quantificação da atividade enzimática, através do método Orto-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo (ONPG), e produção de ácido lático pela determinação da acidez titulável. Os melhores resultados para a atividade de ß-galactosidase foram verificados nos ensaios 1 (1,64 ± 0,06 U mL-1) e 3 (1,34 ± 0,17 U mL-1), que correspondem as condições de ensaio, água de filagem a 30 ºC com 2% de extrato de levedura e água de filagem a 30 ºC com 6 % de suplementação. Enquanto para o ácido lático as maiores produções foram verificadas nos ensaios 2 ( 5,43 ± 0,23 g L-1) e 4 (4,63 ± 0,47 g L-1) constituídos por leitelho a 40 ºC, com 6% de extrato de levedura e água de filagem a 40 ºC com 2% de extrato de levedura. Adicionalmente, os dados experimentais foram submetidos a tratamentos estatísticos por meio de análise de variância (ANOVA) e regressão linear múltipla, possibilitando a obtenção de modelos matemáticos ajustados que descrevem significativamente a variabilidade observada nos intervalos avaliados. A abordagem também permitiu a detecção de possíveis curvaturas na relação entre as variáveis e a verificação da significância da falta de ajuste dos modelos aos dados observados. Desse modo, o estudo possibilitou o conhecimento das principais características da água de filagem e leitelho de manteiga, o isolamento e identificação da bactéria ácido lática Leuconostoc lactis, e a avaliação da atividade enzimática e síntese do ácido lático através da fermentação dos subprodutos de laticínio inoculados com a bactéria isolada

Abstract: Stretching water and buttermilk are agroindustrial byproducts generated in considerable volumes during the production of butter and stretched-curd cheeses. The potential use of these materials is linked to their high nutritional value, which, in addition to promoting environmental sustainability, enables the production of value-added compounds such as lactic acid and ß-galactosidase key inputs in the food and pharmaceutical industries. Both products are commonly obtained through microbial fermentation. Accordingly, this study aimed to evaluate the biotechnological potential of stretching water and buttermilk as substrates for submerged fermentation using a Leuconostoc lactis strain as inoculum for the production of lactic acid and ß-galactosidase. To this end, the byproducts were initially analyzed for their chemical composition. Serial dilutions were inoculated into Man, Rogosa & Sharpe (MRS) medium for microbial isolation, and the isolate was identified through sequencing of the 16S rRNA region. The target products were evaluated as response variables in a full 2³ factorial experimental design with four replicates at the central point. The independent variables considered were substrate composition (stretching water and buttermilk), temperature (30 °C and 40 °C), and yeast extract supplementation (2% and 6%). The flasks were incubated under agitation at 150 rpm for 48 hours, and samples were collected for enzymatic activity quantification using the ortho-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside (ONPG) method, and lactic acid production was determined via titratable acidity. The best results for ß-galactosidase activity were observed in assays 1 (1.64 ± 0.06 U mL?¹) and 3 (1.34 ± 0.17 U mL?¹), corresponding to stretching water at 30 °C supplemented with 2% and 6% yeast extract, respectively. Regarding lactic acid production, the highest values were obtained in assays 2 (5.43 ± 0.23 g L?¹) and 4 (4.63 ± 0.47 g L?¹), which used buttermilk at 40 °C with 6% yeast extract and stretching water at 40 °C with 2% yeast extract, respectively. Additionally, the experimental data were subjected to statistical analysis through analysis of variance (ANOVA) and multiple linear regression, allowing for the development of fitted mathematical models that significantly described the variability observed within the evaluated ranges. This approach also enabled the detection of potential curvature in the relationship between variables and the assessment of the significance of model lack-of-fit. Thus, the study provided insights into the main characteristics of stretching water and buttermilk, enabled the isolation and identification of the lactic acid bacterium Leuconostoc lactis, and assessed both enzymatic activity and lactic acid synthesis through the fermentation of dairy byproducts inoculated with the isolated strain