Selección de levaduras de velo óptimas para los procesos de crianza biológica en bodega y estudio del impacto de las poblaciones de ácaros sobre la calidad del vino Fino

Las levaduras de velo de flor son cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae, capaces de metabolizar fuentes de carbono no fermentables como el etanol o el glicerol mediante oxidación. Para obtener mayor disponibilidad de oxígeno, estas cepas forman un agregado celular en la superficie del medio, conocido como “velo de flor”: una biopelícula que es esencial para la producción de un tipo de vino elaborado en el sur de España, el vino Fino. Para ello, en la denominación de origen protegida (DOP) Montilla- Moriles se realiza una crianza denominada biológica, que combina el envejecimiento del vino en barriles o botas de roble mediante el sistema dinámico de criaderas y solera, con la proliferación del velo de flor en la superficie del vino. Esta crianza produce un impacto químico en el vino, que altera su composición, originando un producto totalmente distinto al que comenzó el proceso de crianza, en el que el contenido en acetaldehído y sus derivados, como son la acetoína, el 1,1-dietoxietano y el 2,3-butanodiol, aumentan su concentración. La integridad del velo de flor se ve condicionada por diversos factores como son los cambios de temperatura, la falta de nutrientes o la presencia de otros microorganismos, como bacterias acéticas. Controlar estas variables es de gran importancia, pues pueden provocar la pérdida del velo de flor y, por consiguiente, la interrupción de la crianza biológica. Otro factor a tener en cuenta es la presencia de artrópodos en la bodega, como son los ácaros, que han sido relacionados de manera positiva con el vino Fino ya que aportan complejidad sensorial al producto, no obstante, aún se desconoce el impacto real de estos arácnidos, a los que se suele asociar de manera negativa con la industria alimentaria, por su capacidad de propagar microorganismos potencialmente patógenos y de ocasionar pérdidas económicas. El grupo de investigación AGR-146 viticultura y enología (VITENOL), en el que se propone esta Tesis Doctoral, trabaja desde 1995, con bodegas de la DOP Montilla- Moriles, en la mejora y optimización del proceso de crianza biológica, mediante la selección de cepas de levadura, asesoramiento científico, estudios proteómicos y metabolómicos de levaduras e inmovilización de estas durante el proceso. Este trabajo se ha enmarcado en la selección de levaduras de velo óptimas para los procesos de crianza biológica en bodega y en el estudio de la influencia de los ácaros en la calidad del vino Fino, siendo los objetivos específicos de esta Tesis Doctoral los siguientes: 1º) Aislar, identificar y caracterizar levaduras de flor de la DOP Montilla- Moriles. 2º) Evaluar el impacto de dichas levaduras de flor en distintas condiciones de estrés durante procesos de microcrianza biológica. 3º) Investigar las poblaciones de ácaros que pueden influir en la calidad de los vinos durante la crianza biológica. 4º) Estudiar y diseñar mecanismos que puedan optimizar la crianza biológica. En la consecución del primer objetivo se identificaron diferentes especies de levaduras en el velo de flor, mediante análisis de la región ITS-1 por metabarcoding y la desorción/ionización láser asistida por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF), encontrando junto a S. cerevisiae, hasta cinco especies más de levaduras no- Saccharomyces: Candida guilliermondii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens, Trichosporon asahii y Wickerhamomyces anomalus, siendo la primera vez que T. asahii y C. guilliermondii han sido aisladas en el velo de flor. Además, se analizó y comparó el vino Fino de aquellas botas con velos de flor compuestos por S. cerevisiae y por levaduras no-Saccharomyces, con vinos Finos cuyos velos de flor estaban formados exclusivamente por S. cerevisiae, incluyendo el estudio de los parámetros enológicos generales y de compuestos volátiles mayoritarios y polioles en dichos vinos. Los resultados del análisis indicaron que la presencia de las levaduras no-Saccharomyces tenía un bajo impacto en las características del vino Fino. No obstante, estos microorganismos podrían ser de utilidad en otros ámbitos, por sus características especiales, como la industria biotecnológica. En el segundo objetivo, se estudió el impacto a nivel de compuestos nitrogenados, de compuestos volátiles mayoritarios y de polioles, que tenían diferentes cepas de levaduras formadoras de velo de flor en vinos de distintas escalas de un sistema de criaderas y solera, destinado a la elaboración de vino Fino. Se observó como cada cepa metaboliza el vino de manera diferente, siendo algunas, en función del vino en el que se inocularon, más eficientes para la crianza biológica que otras. Además, se halló que el contenido en aminas biógenas del vino Fino, previamente atribuido a las bacterias malolácticas, se puede modificar por las levaduras formadoras de velo de flor, lo que podría abrir una vía a su uso para controlar el contenido de este tipo de compuestos en vino Fino. Los resultados obtenidos en este objetivo indican que la selección de cepas formadoras de velo de flor, en función del vino que se quiere someter a crianza biológica, puede ser de gran utilidad para modular ciertos parámetros del vino Fino. De la consecución del tercer objetivo se han identificado dos especies de ácaro en bodegas de crianza biológica de la DOP Montilla-Moriles, la más abundante es Carpoglyphus lactis, una especie de la familia Carpoglyphidae, ya identificada en otros estudios. La segunda es Tyrophagus putrescentiae, un representante cosmopolita de la familia Acaridae, nunca antes descrita en este tipo de ambientes, ambos ácaros se han observado próximos a las biopelículas que hay en bodega, por lo que se ha sugerido que se alimentan de ellas. Se han encontrado y muestreado ácaros en diferentes lugares de bodegas de crianza biológica, desde las tinajas de barro o cemento que contienen el vino yema del año, hasta en botas que almacenan vinos Finos con gran crianza biológica, lo que indica que la presencia de estos artrópodos en bodega es mucho mayor de lo que se pensaba. Durante el muestreo de ácaros, se ha caracterizado a nivel microbiológico una nueva biopelícula, denominada “nata”, que se origina en el exterior de las botas, cuando hay pérdidas de vino entre las duelas de madera. En esta biopelícula, compuesta por numerosos microorganismos destaca la presencia de ácaros y moscas del género Drosophila. Se han identificado un total de 32 especies de microorganismos distintos entre las distintas biopelículas muestreadas (velos de flor y natas) y en el exoesqueleto de los ácaros que se encontraban a su alrededor, siendo 26 de ellos descritos por primera vez en ambientes de crianza biológica. En el cuarto objetivo se empleó una tecnología de inmovilización celular, denominada “biocápsula microbiana” desarrollada por el grupo AGR-146 para la mejora y optimización de la crianza biológica, entre otras aplicaciones. En este caso, se realizaron estudios a escala de laboratorio para investigar el potencial de esta tecnología a la hora de realizar, en mostos de uva Pedro Ximénez, fermentaciones secuenciales con distintas especies de levaduras y así obtener vinos con un perfil sensorial determinado. También, estas biocápsulas, se han empleado como método de inoculación de levaduras de velo de flor en vinos destinados a crianza biológica. En ambos estudios, el uso de las biocápsulas microbianas resultó viable. No obstante, se necesita realizar más ensayos con esta técnica de inmovilización para poder obtener el máximo rendimiento y posteriormente llevar esta tecnología hasta la escala industrial. El conocimiento generado en esta Tesis Doctoral pone de manifiesto la gran diversidad de microorganismos que se encuentra en las bodegas de crianza biológica de la DOP Montilla-Moriles, ayudando a comprender mejor algunos de los factores que intervienen en este proceso, incluidas las poblaciones de ácaros en bodega. Además, incide en la importancia del estudio y empleo de las distintas cepas de S. cerevisiae formadoras de velo de flor, que pueden ser de gran interés a la hora de optimizar el proceso de crianza biológica. Esta Tesis Doctoral abre nuevas vías de investigación para futuros trabajos con los microorganismos identificados en los diferentes ambientes muestreados, ya sea en procesos estrictamente enológicos o en otras ramas de interés biotecnológico.

Flor yeast are Saccharomyces cerevisiae strains, capable of metabolizing nonfermentable carbon source such as ethanol or glycerol through oxidation. To obtain a higher oxygen availability, these strains form a cellular aggregation on the medium surface known as “velo de flor”: an essential biofilm for the production of a type of wine elaborated in southern Spain- the Fino wine. For this purpose, in the Montilla-Moriles protected designation of origin (PDO), a biological aging process is carried out, which combines the aging of the wine in oak barrels or casks using the dynamic system of “criaderas and solera”, with the proliferation of the flor yeast on the wine's surface. This aging produces a chemical impact on the wine, altering its composition, resulting in a totally different product from the one that began the aging process, in which the content of acetaldehyde and its derivatives, such as acetoin, 1,1-diethoxyethane, and 2,3- butanediol, increase in concentration. Flor yeast integrity is conditioned by various factors: temperature changes, lack of nutrients and the presence of other microorganisms, like acetic acid bacteria. Controlling these variables is of great importance, as they can cause the loss of the flor yeast and consequently, the interruption of biological aging. Another factor to consider is the presence of arthropods in the cellar, such as mites, which have been positively associated with Fino wine as they add sensory complexity to the product. However, the real impact of these arachnids, which are usually negatively associated with the food industry due to their ability to spread potentially pathogenic microorganisms and cause economic losses, is still unknown. AGR-146 viticulture and enology research group (VITENOL) has been working since 1995 with wineries of the Montilla-Moriles PDO, on the improvement and optimization of the biological aging process, through the selection of yeast strains, scientific advice, proteomic and metabolomic studies of yeasts, and their immobilization during the process. This work focuses on the selection of optimal flor yeast strains for biological aging processes in wineries and the study of the influence of mites in Fino wine quality. The specific objectives of this doctoral thesis are as follows: 1º) Isolate, identify, and characterize flor yeast from the Montilla-Moriles PDO. 2º) Evaluate the impact of these flor yeast under different stress conditions during biological microaging. 3º) Investigate the mite populations that may influence wine quality during biological aging. 4º) Study and design mechanisms which could optimize biological aging. In the completion of the first objective, different yeast species were identified in the flor yeast through analysis of the ITS-1 region by metabarcoding and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF). Along with S. cerevisiae, up to five non-Saccharomyces yeast species were found: Candida guilliermondii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens, Trichosporon asahii, and Wickerhamomyces anomalus, with T. asahii and C. guilliermondii being isolated from the flor yeast for the first time. Additionally, Fino wine from barrels with flor yeast composed of S. cerevisiae and non-Saccharomyces yeast was analyzed and compared with Fino wines whose flor yeast were formed exclusively by S. cerevisiae. This included the study of general oenological parameters and major volatile compounds and polyols in these wines. The results of the analysis indicated that the presence of non-Saccharomyces yeast had a low impact on the characteristics of Fino wine. However, these microorganisms could be useful in other fields, such as the biotechnology industry, due to their special characteristics. For the second objective, the impact on nitrogenous compounds, major volatile compounds, and polyols was studied for different flor yeast strains in wines from various scales of a criaderas and solera system, intended for the production of Fino wine. It was observed that each strain metabolizes the wine differently, with some being more efficient for biological aging than others, depending on the wine in which they were inoculated. Additionally, it was found that the biogenic amine content of Fino wine, previously attributed to malolactic bacteria, can be modified by flor-forming yeasts, which could open a way to use them to control the content of these types of compounds in Fino wine. The results obtained in this objective indicate that the selection of flor-forming strains, based on the wine to be subjected to biological aging, can be very useful for modulating certain parameters of Fino wine. From the completion of the third objective, two mite species have been identified in biological aging wineries of the Montilla-Moriles PDO. The most abundant is Carpoglyphus lactis, a species of the Carpoglyphidae family, already identified in other studies. The second is Tyrophagus putrescentiae, a cosmopolitan representative of the Acaridae family, never before described in this type of environment. Both mites have been observed close to the biofilms in the winery, suggesting that they feed on them. Mites have been found and sampled in different places of biological aging wineries, from clay or cement jars containing the young yema wine, to barrels storing highly biologically aged Fino wines, indicating that the presence of these arthropods in the winery is much greater than previously thought. During the mite sampling, a new biofilm, called "nata" (cream), which originates on the barrel’s exterior when there are wine leaks between the wooden staves, has been characterized at a microbiological level. In this biofilm, composed of numerous microorganisms, the presence of mites and flies of the genus Drosophila stands out. A total of 32 different microorganism species have been identified among the various sampled biofilms (flor yeast and natas) and on the exoskeleton of the mites found around them, with 26 of them being described for the first time in biological aging environments. For the fourth objective, a cell immobilization technology called "microbial biocapsule," developed by the AGR-146 group, was used for the improvement and optimization of biological aging, among other applications. In this case, laboratory-scale studies were conducted to investigate the potential of this technology in performing sequential fermentations with different yeast species in Pedro Ximénez grape musts, thus obtaining wines with a specific sensory profile. These biocapsules have also been used as a method of inoculating flor yeasts in wines destined for biological aging. In both studies, the use of microbial biocapsules was viable. However, more studies with this immobilization technique are needed to obtain maximum performance and subsequently employ this technology to an industrial scale. The knowledge generated in this doctoral thesis highlights the great diversity of microorganisms found in the biological aging wineries of the Montilla-Moriles PDO, helping to better understand some of the factors involved in this process, including mite populations in the cellars. Furthermore, it emphasizes the importance of studying and using different flor-forming S. cerevisiae strains, which can be of great interest when optimizing the biological aging process. This doctoral thesis opens new avenues of research for future work with the microorganisms identified in the different sampled environments, whether in strictly oenological processes or in other branches of biotechnological interest.