Protokollutveckling förprovförberedelse avvassleprotein koncentrat införflödescytometrianalys

Vassleprotein koncentrat (WPC) är en proteinrik biprodukt från ostproduktion somvanligtvis analyseras mikrobiologiskt med odlingsbaserade metoder. Dessa metoderär dock tidskrävande och orsakar ekonomiska förluster vid fördröjda analysresultat.Syftet med denna studie var att undersöka om flödescytometri kan användas som ettsnabbare alternativ för att analysera bakterieinnehåll i WPC. För att möjliggörasådan analys utvecklades en provberedningsmetod som syftar till att minska provetsviskositet och avlägsna störande komponenter utan att påverka bakteriernasintegritet. Prover av WPC förbehandlades med enzymet Proteinase K i olikakoncentrationer och inkubationstider. Dessutom testades pH-justering ochproteinutfällning för att optimera separationen mellan proteiner och bakterier.Proverna analyserades med både traditionell odling och flödescytometri, där levandeoch döda celler färgades med SYTO 9 respektive propidiumjodid (PI). Resultatenvisade att Proteinase K snabbt reducerade proteinhalten i WPC, men samtidigtkunde främja bakterietillväxt vid längre inkubationstider. Odlingarna visade attbakterier huvudsakligen återfanns i pelleten och den första supernatanten, samt attbehandling med enzym eller pH-justering påverkade tillväxtmönstret. Streptococcusthermophilus var en av de vanligast förekommande bakterierna i proverna.Flödescytometri visade begränsad förmåga att skilja levande från döda celler,särskilt i kontroller där hög bakgrund och låg cellkoncentration påverkademätningarnas noggrannhet. En oväntat stor andel levande celler detekterades även idöda kontroller, vilket tyder på att färgningen kan störas av WPC:s komplexasammansättning. Sammanfattningsvis visade studien att en effektiv provberedningär avgörande inför flödescytometrisk analys. Däremot behöver bådefärgningsprotokoll och flödescytometri anpassas bättre till WPC. För framtidastudier rekommenderas optimering av färgningsprotokoll samt utvärdering avalternativa fluoroforer och enzymatiska förbehandlingar.

Whey protein concentrate (WPC) is a protein-rich byproduct of cheese productionthat is commonly analyzed microbiologically using culture-based methods.However, these methods are time-consuming and may lead to economic losses dueto delayed analysis results. The aim of this study was to investigate whether flowcytometry could serve as a faster alternative for analyzing bacterial content in WPC.To enable such analysis, a sample preparation method was developed to reduce theviscosity and remove interfering components without compromising bacterialintegrity. WPC samples were pretreated with the enzyme Proteinase K at varyingconcentrations and incubation times. Additionally, pH adjustment and proteinprecipitation were tested to optimize the separation of proteins and bacteria. Thesamples were analyzed using both traditional culturing and flowcytometry, wherelive and dead cells were stained with SYTO 9 and propidium iodide (PI),respectively. The results showed that Proteinase K rapidly reduced the proteincontent in WPC but could also promote bacterial growth at longer incubation times.Culturing revealed that bacteria were primarily found in the pellet and the firstsupernatant, and that enzymatic treatment or pH adjustment affected the growthpattern. Streptococcus thermophilus was identified as one of the most frequentlyoccurring bacteria in the samples. Flowcytometry showed limited ability todistinguish live from dead cells, particularly in controls where high background andlow cell concentrations affected measurement accuracy. An unexpectedly highproportion of live cells was also detected in dead controls, suggesting that thestaining process may be disrupted by the complex composition of WPC. Inconclusion, the study demonstrated that effective sample preparation is crucial forflow cytometric analysis. However, staining protocols and flow cytometry itselfneed to be better adapted to WPC. Future studies are recommended to optimizestaining procedures and evaluate alternative fluorophores and enzymaticpretreatments.