Molecular mechanisms of Theileria annulata host cell transformation and drug resistance | Molekulare Mechanismen der Wirtszelltransformation und Arzneimittelresistenz von Theileria annulata

In tropical theileriosis of cattle, the major driver of pathology is the transformation of host macrophagesby the intracellular apicomplexan parasite Theileria annulata. In Theileria-transformed leukocytes, several oncogene-associated signaling pathways including Activator Protein 1 (AP-1) and NF-κB, are constitutively activated in a parasite-dependent manner. These pathways are essential for proliferation, dissemination and resistance to apoptosis in infected cells. The exact mechanisms employed by Theileria to constitutively activate these pathways is not fully known. Taking other Apicomplexans such as Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum as models, Theileria might achieve this via secretion of effector proteins. Here we studied the contribution of a secreted T. annulata effector protein Ta9 to the transcriptional de-regulation of bovine macrophage genes by performing RNA-seq on macrophages that stably expressed Ta9. Ta9 was previously shown to be capable of stimulating AP-1-driven transcription when introduced into human HEK cells in luciferase reporter assays. RNA-seq analysis revealed that Ta9 affected the expression of 560 (400 upregulated and 160 downregulated) bovine genes that included oncogenes, tumor suppressor genes and inflammation-associated genes previously known or hypothesized to be involved in the pathogenesis of tropical theileriosis. Example genes include FRA1, IL-6, TGFß1, TNFɑ, MMP2 and the proto-oncogene haematopoetic cell kinase (HCK). We further characterized the contribution of HCK to the Theileria-induced leukocyte transformation by using a selective HCK inhibitor (A419219) in cell proliferation and transformation (soft agar colony formation) assays. HCK belongs to the SRC family of non-receptor tyrosine kinases that is constitutively active in T. parvatransformed B cells and contributes to AP-1-driven transcription (similar to Ta9). This raised the possibility that Ta9 might do so by augmenting HCK signaling. Indeed, Ta9-mediated upregulation of hck (as detected first by RNA-seq) was confirmed by qRT-PCR and the increase in protein levels by immunofluorescence (IF). Furthermore, Ta9-expressing cells grew membrane protrusions and microspikes. These results were consistent with Ta9 potentially augmenting HCK activity in the cells and treatment of T. annulata-infected macrophages with A419219 negatively impacted on the parasite-dependent transformed phenotype. A419219 could also block proliferation of sheep leukocytes transformed by another acutely pathogenic Theileria species, T. lestoquardi. Buparvaquone is currently the only drug in the market to treat T. annulata, T. lestoquardi and T. parva infections, however resistance is spreading worldwide and the need to for a drug to replace buparvaquone is rising. Due to the therapeutic effect that HCK inhibition showed against T.annulata- and T. lestoquardi-transformed leukocytes in our hands, as a parallel part of this project we generated buparvaquone-resistant T. annulata parasites and tested whether A419219 could block the proliferation of macrophages that harbored resistant parasites. As expected, A419219 was equally effective against macrophages containing buparvaquone-resistant parasites. Past studies have reported susceptibility of T. parva transformed leukocytes to Src kinase inhibitors and herein we have extended that reports to T. annulata and T. lestoquardi infections and to buparvaquone-resistant T. annulata parasites. Therefore, the ensemble highlights the importance of Src kinases as potential targets for the consideration in the development of the next generation of therapies against theileriosis.

In der tropischen Theileriose des Rindes ist der Haupttreiber der Pathologie die Transformation von Wirtsmakrophagen durch den intrazellulären Apicomplexa-Parasiten Theileria annulata. In Theileriatransformierten Leukozyten werden mehrere mit Onkogenen assoziierte Signalwege, darunter der Activator Protein 1 (AP-1) und NF-kB-Wege, parasitenabhängigen konstitutiv aktiviert. Diese Signalwege sind essenziell für die Proliferation, Dissemination und Apoptoseresistenz der infizierten Zellen. Die genauen Mechanismen, mit denen Theileria diese Signalwege dauerhaft aktiviert, sind nicht vollständig geklärt. Unter Berücksichtigung anderer Apicomplexa wie Toxoplasma gondii und Plasmodium falciparum könnte Theileria dies durch die Sekretion von Effektorproteinen bewirken. In der vorliegenden Studie untersuchten wir den Beitrag eines sekretorischen T. annulata-Effektorproteins, Ta9, zur transkriptionellen Deregulation boviner Makrophagengene, indem wir RNA-Seq an Makrophagen durchführten, die stabil Ta9 exprimierten. Frühere Luziferase-Reporter-Assays zeigten, dass Ta9 die AP-1-gesteuerte Transkription humane HEK-Zellen stimuliert. Die RNA-Seq-Analyse identifizierte 560 differenziell exprimierte bovine Gene (400 hoch-, 160 herunterreguliert), darunter Onkogene, Tumorsuppressorgene und entzündungsassoziierte Gene, die bereits als potenziell an der Pathogenese der tropischen Theileriose beteiligt identifiziert oder vermutet wurden. Beispiele hierfür sind FRA1, IL-6, TGFß, TNFɑ, MMP2 und das Proto-Onkogen haematopoietic cell kinase (HCK). Wir untersuchten weiter den Beitrag von HCK zur Theileria-induzierten Leukozytentransformation durch den Einsatz eines selektiven HCK-Inhibitors (A419219) in Zellproliferations- und Transformationstests (Soft-Agar-Koloniebildung). HCK gehört zur SRC-Familie der nicht-rezeptorassoziierten Tyrosinkinasen, die in T. parva-transformierten B-Zellen konstitutiv aktiv ist und zur AP-1-gesteuerten Transkription beiträgt (ähnlich wie Ta9). Dies legte die Möglichkeit nahe, dass Ta9 HCK-Signalwege verstärken könnte. Tatsächlich bestätigten wir die durch RNA-Seq detektierte Ta9-vermittelte Hochregulation von hck durch qRT-PCR sowie den Anstieg der Proteinspiegel mittels Immunfluoreszenz (IF). Darüber hinaus bildeten Ta9-exprimierende Zellen Membranprotrusionen und Mikrospikes aus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ta9 die HCK-Aktivität in den Zellen potenziell verstärken könnte. Die Behandlung von T. annulata-infizierten Makrophagen mit A419219 beeinträchtigte zudem den parasitenabhängigen transformierten Phänotyp. A419219 blockierte auch die Proliferation von Schafsleukozyten, die durch eine weitere akut pathogene Theileria-Spezies, T. lestoquardi, transformiert wurden. Derzeit ist Buparvaquone das einzige verfügbare Medikament zur Behandlung von Infektionen mit T. annulata, T. lestoquardi und T. parva. Allerdings breiten sich Resistenzen weltweit aus, was die Notwendigkeit für ein alternatives Medikament verstärkt. Aufgrund der therapeutischen Wirkung von HCK-Inhibitoren gegen T. annulata- und T. lestoquardi-transformierte Leukozyten haben wir in einem parallelen Projekt Buparvaquone-resistente T. annulata-Parasiten erzeugt und getestet, ob A419219 die Proliferation von Makrophagen, die resistente Parasiten enthalten, blockieren kann. Wie erwartet, war A419219 auch gegen Makrophagen mit Buparvaquone-resistenten Parasiten wirksam. Frühere Studien berichteten über die Empfindlichkeit T. parva-transformierter Leukozyten gegenüber Src-Kinase-Inhibitoren. Unsere Ergebnisse erweitern diese Beobachtungen auf T. annulata und T. lestoquardi sowie auf Buparvaquon-resistente T. annulata-Parasiten. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Bedeutung von Src-Kinasen als potenzielle Ziele für die Entwicklung neuer Therapien gegen Theileriose.