Avaliação de estratégias de imobilização e estabilização de β-galactosidase de Bacillus licheniformis | Evaluation of β-galactosidase immobilization and stabilization strategies from Bacillus licheniformis

The dairy industry has expressive participation in the food sector, with the production of dairy products with lactose content reduced by the enzyme β-galactosidase, in increasing demand. Lactose-free products have a higher production cost than dairy products with lactose due to the enzymatic hydrolysis step using soluble enzymes, so the use of immobilized β- galactosidase emerge as an alternative to the high cost of enzymes in their free form Researchesare continuously directed to improve the biocatalyst, using supports and conditions that make the final process feasible and improved. At the first moment in the research, an exploratory study was carried out on the effect caused by ionic strength and pH in the process of immobilization by physical adsorption on Duolite A 568 support. High concentrations of the Britton-Robinson (BR) buffer solution were used, from 300 mM to 1000 mM, varying the pH between 3.5 to 4.5, keeping the immobilization time at 2 hours. During the experiments, the unexpected appearance of enzymatic clusters (granules) was observed, which showed relevant enzymatic activity of 719 (U) at pH 4.0 (300 mM), 767 U at pH 4.5 (300 mM) and 348 U at pH 4.0 (500 mM), indicating possible support-free immobilization. For high buffer molarity conditions (1000 mM), the results showed no improvement in the activity of the immobilized enzyme. In sequence, the joint influence of ionic strength and immobilization time in a central rotational composite design (PCCR) was evaluated together with the analysis of the immobilization process by the yield, efficiency and recovery responses. For the hydrolytic activity of the β-galactosidase enzyme, the best results were between 396 U to 470 U, which were concentrated in short or long periods associated with low ionic strength conditions, evidencing the interaction effect in the studied ranges between the BR buffer concentration (5. 12 to 99.88) and time (0.46 to 6.12 hours).In the parameters of the effect of the analysis of the immobilization performance in observation the highest activity of the enzyme of 470 U under conditions of 86 mM in 5.3h one of the best regions was obtained 91.01 of yield, 96.71 of efficiency and 88, 01 recovery proving to be a good approach to deepening in new research. This research demonstrated that the concentration of the ionic strength of the buffer with defined times and pH of the composition of the medium are important parameters that affect the catalytic active site of the enzyme in its stability, which can benefit or inhibit the activity of the immobilized enzyme.

Dissertação (Mestrado)

A indústria de laticínios tem participação expressiva no setor de alimentos, tendo a produção de produtos lácteos com teor de lactose reduzido pela enzima β-galactosidase, com crescente demanda. O custo destes produtos sem lactose é maior do que produtos lácteos com lactose devido a etapa de hidrólise enzimática empregando enzimas solúveis, assim o uso da β-galactosidase imobilizada surge como alternativa face ao alto custo de enzimas em sua forma livre. As pesquisas são continuamente direcionadas para se aperfeiçoar o biocatalisador, utilizando suportes e condições que viabilizem e melhorem o processo final. No primeiro momento da pesquisa foi realizado um estudo exploratório do efeito causado pela força iônica e pH no processo de imobilização por adsorção física em suporte Duolite A 568. Empregou-se elevadas concentrações da solução tampão Britton-Robinson (BR) de 300 mM a 1000 mM variando o pH entre 3,5 a 4,5 mantendo o tempo de imobilização em 2 horas. Durante os experimentos foi observado o surgimento inesperado de aglomerados (grânulos) enzimáticos, aos quais verificou-se relevante atividade enzimática de 719 (U) em pH 4,0 (300 mM), 767 U em pH 4,5 (300 mM) e 348 U em pH 4,0 (500 mM), com indicativo de possível imobilização livre de suporte. Para as condições de alta molaridade de tampão (1000 mM), os resultados não demonstraram melhora na atividade da enzima imobilizada. Na seqüência avaliou-se a influência conjunta da força iônica e tempo de imobilização em um planejamento composto central rotacional (PCCR) juntamente com a análise do processo de imobilização pelas respostas de rendimento, eficiência e recuperação. Na atividade hidrolítica da enzima β-galactosidase os melhores resultados foram entre 396 U a 470 U, que se concentraram em tempos curtos ou longos associados a condições de baixa força iônica, evidenciando o efeito de interação nas faixas estudadas entre a concentração do tampão BR (5,12 a 99,88) e tempo (0,46 a 6,12 horas). Nos parâmetros do efeito da análise do desempenho da imobilização em observação a maior atividade da enzima de 470 U em condições de 86 mM em 5,3h uma das melhores regiões obteve-se 91,01 de rendimento, 96,71 de eficiência e 88,01 de recuperação demostrando ser uma boa abordagem de aprofundamento em novas pesquisas. Esta pesquisa demostrou que a concentração da força iônica do tampão com tempos definidos e pH da composição do meio são parâmetros importantes que afetam o sítio ativo catalítico da enzima em sua estabilidade, podendo beneficiar ou inibir a atividade da enzima imobilizada.