Cloning of the coat protein gene of SMV with the PCR approach

anglais. SMV is RNA virus had to be converted to the first strand DNA using oligo (dT) and murine reverse transcriptase. Amplification of coat protein gene region was carried out by Polimerase Chain Reaction (PCR) with two primers, 5'TACATCTTGGAACCAATGGCAAGGAGAGAAG3' and 5'AGGACAACAAACATTGCCG3'. The PCR product was blund ended by Sl nuclease, and ligated into SmaI digested pUC18 and phosphatase treatment by calf intestine phosphatase. Ligation mixture was used to transform E. coli DH5 alpha. Recombinant plasmid was digested with EcoRI and HindIII showed 0,8 kb fragment. Southern blot analysis at high strigency using PCR product as a probe shows that the 0,8 kb fragment produced intense signal

indonésien. SMV merupakan virus RNA sehingga sebagai langkah pertama dalam penelitian ini perlu dilakukan sintesis untai pertama cDNA dengan menggunakan primer oligo-(dT) dan murine reverse transcriptase. Kemudian amplifikasi daerah gen coat protein dilakukan dengan metode Polimerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan untai pertama cDNA sebagai cetak awal dan dua primer yang terdiri dari 5'-TACATCTTGGAACCAATGGCAGGCAAGGAGAGAAG-3' dan 5'-AGGACAACAAACATTGCCG-3'. Hasil PCR dibuat papak dengan nuklease sl, diligasikan dengan pUC18 yang telah dipotong dengan SmaI dan dihilangkan ujung fosfatnya dengan calf intestine phosphatase (CIP). Transformasi dilakukan pada E. coli DH5 alpha. Plasmid rekombinan yang didigesti dengan EcoRI dan Hind/III menunjukkan fragmen 0,8 kb. Analisis Southern blot pada suhu tinggi dengan pelacak fragmen hasil PCR menunjukkan fragmen tersebut memberikan signal kuat