3D-Strukturanalyse von Molluskenhämocyaninen aus elektronenmikroskopischen Bildern

Diese Arbeit präsentiert die bislang höchst aufgelösten KryoEM-Strukturen für ein Cephalopoden hämocyanin Dekamer (Nautilus pompilus Hämocyanin, NpH) und ein Gastropoden Hämocyanin Didekamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1). Durch die Methoden des “molecular modelling” und “rigid-body-fiting” wurde auch eine detaillierte Beschreibung beider Strukturen auf atomarem Niveau erstmalig möglich. Hämocyanine sind kupferhaltige Sauerstoff-Transportproteine die frei gelöst in Blut zahlreicher Arthropoden und Mollusken vorkommen. Allgemein sind Molluskenhämocyanine als Dekamere (Hohlzylinder aus 5 Untereinheiten-dimere) oder Didecamere (Zusammenlagerung von zwei Dekameren) zu finden. Durch Anlagerung weiterer Dekamere bilden sich teilweise tubuläre Multidekamere. Hämocyanine der Cephalopoden bestehen ausschließlich aus solitären Decameren. In Octopus und Nautilus bestehen die 10 Untereinheiten aus 7 funktionellen Einheiten(FU-a bis FU-g), wobei jede FU ein Sauerstoffmolekül binden kann. FUs a-f bilden die Wand des ringförmigen Moleküls und 10 Kopien der FU-g bilden einen sogenannten „inneren Kragenkomplex“. Das im Rahmen dieser Arbeit erstelltes molekulares Modell von NpH klärt die Struktur des Dekamers vollständig auf. Wir waren zum ersten Mal in der Lage das Untereinheiten-dimer, den Verlauf der Polypeptidkette und 15 unterschiedliche Kontaktstellen zwischen FUs zu identifizieren. Viele der inter-FU-Kontakte weisen Aminosäurenkonstellationen auf, die die Basis für die Übertragung allosterischer Wechselwirkungen zwischen FUs darstellen könnten und Hinweise für den Aufbau der allosterische Einheit geben. Potentielle Bindungsstellen für N-glykosidische Zucker und bivalente Kationen wurden auch identifiziert. Im Gegensatz zu NpH, kommen Gastropoden Hämocyanine (inkl. KLH) hauptsächlich als Didekamere vor und der Kragenkomplex wird in diesem Fall aus 2 FUs gebildet (Fu-g und FU-h). Die zusätzliche C'-terminale FU-h zeichnet sich durch eine spezielle Verlängerung von ~ 100 Aminosäuren aus. KLH stammt aus der kalifornische Schnecke Megathura crenulata und kommt seit mehreren Jahrzehnten als Immunostimulator in der immunologischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendung zum Einsatz. KLH weist zwei Isoformen auf, KLH1 und KLH2. Das vorliegende Modell von KLH1 erlaubt die komplexe Architektur dieses riesigen Proteins in allen Details zu verstehen, sowie einen Vergleich zum dem NpH Dekamer auf atomare Ebene. Es wurde gefunden, dass das Untereinheitensegment a-b-c-d-e-f-g, sowie die equivalenten Kontaktstellen zwichen FUs stark konserviert sind. Dies deutet darauf hin, dass in Bezug auf die Übertragung allosterische Signale zwischen benachbarten FUs, grundlegende Mechanismen in beiden Molekülen beibehalten wurden. Weiterhin, konnten die Verbindungen zwischen den zwei Dekameren ertsmalig identifiziert werden. Schließlich, wurde die Topologie der N-glycosidischen Zucker, welche für die immunologische Eigenschaften von KLH1 von großer Bedeutung sind, auch aufgeklärt. Somit leistet die vorliegende Arbeit einen wesentlichen Schritt zum Verständnis der Quartärstruktur und Funktion der Molluskenhämocyanine.rn

This work presents the currently highest resolution cryoEM structures (9 Ǻ) of a cephalopod hemocyanin decamer (Nautilus pompilius hemocyanin, NpH) and a gastropod hemocyanin didecamer (keyhole limpet hemocyanin isoform 1, KLH1) and their complete molecular models,obtained by advanced molecular modelling and rigid body fitting. Hemocyanins are blue copper proteins that transport oxygen in the hemolymph of many arthropods and molluscs. Molluscan hemocyanins are found either as decamers (five subunit dimers assembled as a hollow cylinder), or didecamers (face-to-face assembly of two decamers), which sometimes bind more decamers to form tubular multi-decamers. In cephalopods, only the single decamer is present. The polypeptide subunit contains seven functional units (termed FU-a to g), each of which binds one oxygen molecule. Sixty FUs form the cylinder wall (FUs a to f, each of the 10 subunits) and the remaining 10 copies of FU-g fold in to form an internal collar complex. The present molecular model of NpH fully explains the intricate quaternary structure of the decamer. It has allowed for the first time identification of the subunit dimer, the pathway of the subunit and 15 types of molecular inter-FU interfaces. Many of these interfaces have amino acid constellations that might transfer allosteric interaction between FUs and give hints for the allosteric unit. Moreover, the potential N-glycan and calcium/magnesium binding sites have emerged.In contrast to NpH, gastropod hemocyanins (including KLH) are didecamers and the collar contains an additional FU-type, termed FU-h, which is enlarged by an extension of ~100 aminoacids. KLH is obtained from the Californian keyhole limpet Megathura crenulata and intensively applied, in immunological research and clinics, as an immunoactivator and tumour vaccinerncarrier; it occurs in two isoforms termed KLH1 and KLH2. The present hybrid model of KLH1 allows for the first time detailed insight into the quaternary structure of this gastropod hemocyanin at a pseudo-atomic level. We have found that the wall-arc structure of the KLH1 decamer is very similar to that of NpH. The pathway of the subunit segment a-b-c-d-e-f-g is conserved and with respect to allosterism, the surprising conservation of the 15 molecular interfaces that also exist in NpH suggests that basic structures are maintained in both molecules. Moreover, we were able to trace how the pathway continues from FU-g to FU-h and completely solve the old mystery of the gastropod hemocyanin collar. In addition, the present model shows, for the first time, the contact zones between the two decamers. And ultimately, it reveals the potential attachment sites for N-linked glycans that might be primarily responsible for the observed immunological effects. Thus, the present results essentially solve many long debated questions on the architecture and function of these giant respiratory invertebrate proteins.