Le coût énergétique du métabolisme primaire et de l'expansion vacuolaire : Des acteurs centraux pour le développement des feuilles de tomates en nutrition ammoniacale | The energy cost of primary metabolism and vacuole expansion : Central to shape tomato leaf development under ammonium nutrition

anglais. Ammonium (NH4+) is a nitrogen source of great interest in the context of sustainable agriculture. Its application in the field together with nitrification inhibitors has been extensively proven efficient to limit detrimental N losses compared to the use of nitrate (NO3-). NH4+ is a common intermediate involved in numerous metabolic routes. However, high NH4+ concentrations may lead to a stress situation provoking a set of symptoms collectively known as “ammonium syndrome” mainly characterized by growth retardation. Those symptoms are caused by a combination of, among others, a profound metabolic reprogramming, disruption of photosynthesis, pH deregulation and ion imbalance. Numerous studies have described the way plant copes to ammonium nutrition. However, the organ developmental stage has been generally neglected.To fill in this gap, in the first chapter we first aimed studying how the metabolism is adapted in function of the leaf position in the vertical axis of the tomato plants (Solanum lycopersicum) grown with NH4+, NO3- or NO3NH4 supply. To do so, we dissected leaf biomass composition and metabolism through a complete analysis of metabolites, ions and enzyme activities. The results showed that C and N metabolic adjustment in function of the nitrogen source was more intense in older leaves compared to younger ones. Importantly, we propose a trade-off between NH4+ accumulation and assimilation to preserve young leaves from ammonium stress. Besides, NH4+-fed plants exhibited a rearrangement of carbon skeletons with a higher energy cost respect to plants supplied with NO3-. We explain such reallocation by the action of the biochemical pH-stat, to compensate the differential proton production that depends on the nitrogen form provided.Ammonium nutrition may limit cell expansion, suggesting that the cellular processes involved would be altered. Among others, cell growth is largely dependent of the internal pressure exerted on the cell wall by the vacuole. However, the role of the vacuole in ammonium stress has been rarely addressed. In the second chapter, we evaluated the effect of ammonium stress on leaf development with a special focus on vacuole expansion and metabolism. To carry out this aim, we monitored the leaf development from its appearance until its complete expansion in plants grown under NH4+ or NO3- as unique nitrogen source. Cytological analysis evidenced that the reduced cell expansion under ammonium nutrition was associated with smaller vacuole size. Besides, we reported an acidification of the vacuole of NH4+-fed plants compared to nitrate nutrition. Moreover, a model was built to predict the thermodynamic equilibrium of different soluble species across the tonoplast. The model was set up through an extensive reviewing of vacuolar transporters and integrated subcellular volumes, vacuolar electrochemical gradients and the formation of ionic complex in the vacuole to fit the subcellular concentration of ions, organic acids and sugars measured in the leaf. Further, predictions obtained with the model were cross validated with data from non-aqueous fractionation. Firstly, the entrance of solutes was higher in vacuoles of NO3--fed leaves but was not associated with higher vacuolar osmolarity likely because of the adjustment of the vacuolar volume. In this sense, we proposed that the lack of malate in cells of ammonium-fed leaves was central in the limitation of vacuolar expansion. Secondly, we conclude that the energy cost of solute transport into the vacuole is higher under NH4+ nutrition because of the higher electrochemical gradient generated by the proton pumps across tonoplast.This work highlights the importance of considering leaf phenological state when studying nitrogen metabolism. In addition, our integrated approach place cytosolic pH control and vacuole expansion in the center of tomato leaf adaptation to ammonium stress and pave the way for future studies in the field of ammonium nutrition.

français. L'ammonium (NH4+) est une source d'azote d'un grand intérêt dans le cadre d'une agriculture durable. Son application en champs avec des inhibiteurs de nitrification s’est montré efficace pour limiter les pertes de N par rapport à l'utilisation de nitrate (NO3-). NH4+ est un intermédiaire commun impliqué dans de nombreuses voies métaboliques. Cependant, des concentrations élevées peuvent conduire à une situation de stress chez la plante provoquant un « syndrome ammoniacal », caractérisé par une croissance réduite. Ces symptômes sont causés par la combinaison, entre autres, d'une reprogrammation métabolique, d'une perturbation de la photosynthèse, d'une dérégulation du pH et d'un déséquilibre ionique. De nombreuses études ont décrit la façon dont la plante s’adapte à la nutrition ammoniacale. Cependant, le stade de développement des organes a été souvent négligé.Pour combler cette lacune, dans le premier chapitre nous étudions comment le métabolisme s’adapte en fonction de la position des feuilles sur l'axe vertical de plants de tomates (Solanum lycopersicum) cultivées en présence de NH4+, NO3- ou NO3NH4. Nous avons disséqué la composition de la biomasse foliaire et le métabolisme grâce à une analyse complète des métabolites, ions et activités enzymatiques. Nos résultats montrent que l'ajustement métabolique du C et du N en fonction de la source d'azote était plus intense chez les feuilles âgées par rapport au plus jeunes. Surtout, nous révélons un compromis entre l'accumulation de NH4+ et l'assimilation afin de préserver les jeunes feuilles du stress ammoniacal. Par ailleurs, les plantes alimentées en NH4+ présentaient un réarrangement des squelettes carbonés impliquant un coût énergétique élevé. Nous expliquons une telle réallocation par l'action du pH-stat biochimique, pour compenser la production différentielle de protons dépendante de la forme azotée fournie.La nutrition ammoniacale peut limiter l'expansion cellulaire. Entre autres, la croissance cellulaire dépend largement de la pression interne exercée par la vacuole sur la paroi cellulaire. Cependant, l’impact du stress ammoniacal sur la vacuole a été rarement abordé. Dans le second chapitre, nous évaluons l'effet de la nutrition ammoniacale sur le développement des feuilles en se focalisant sur l'expansion et le métabolisme vacuolaire. Pour cela, nous avons suivi le développement d’une feuille depuis son apparition jusqu'à son expansion complète avec du NH4+ ou NO3- comme seule source d'azote. Nous avons d’abord mis en évidence que la réduction de l’expansion cellulaire en nutrition ammoniacal était associée à des vacuole plus petite et aussi plus acide que celles recevant du NO3-. De plus, un modèle a été construit pour prédire l'équilibre thermodynamique de différentes espèces solubles de part et d’autre du tonoplaste. Le modèle intègre les volumes subcellulaires, les gradients électrochimiques et la formation de complexe ionique dans la vacuole afin de prédire les concentrations subcellulaires des ions, acides organiques et sucres mesurée dans la feuille. De plus, ces prédictions ont été validées avec des données obtenus par fractionnement non aqueux. Finalement, l’estimation des flux de soluté dans la vacuole nous a permis de démontrer que la déficience en malate dans les cellules des feuilles nourries avec NH4+ est central dans la limitation de l'expansion vacuolaire. De plus, nous concluons que le coût énergétique du transport de soluté dans la vacuole est plus élevé sous nutrition ammoniacale en raison du gradient électrochimique plus élevé généré de part et d’autre du tonoplaste. Ce travail souligne l'importance de considérer l'état phénologique des feuilles lors de l'étude du métabolisme de l'azote. De plus, notre approche place le contrôle du pH cytosolique et l'expansion des vacuoles au centre de l'adaptation des feuilles de tomate à ce stress et ouvre la voie à de futures études dans le domaine de la nutrition ammoniacal.