Estratégias de suplementação de L-carnitina no protocolo de verificação de embriões ovinos da raça Santa Inês produzidos in vivo.

Resumno: A vitrificação representa uma importante ferramenta em programas de melhoramento genético dos rebanhos, pois permite a criopreservação de gametas e embriões com menor percentual de crioinjúrias. Entretanto, lesões causadas nas organelas durante a criopreservação comprometem a taxa de sobrevivência dos embriões após o reaquecimento. Neste contexto, este estudo objetivou avaliar duas estratégias de suplementação com L-carnitina (modulador de atividade mitocondrial) na vitrificação de embriões ovinos da raça Santa Inês produzidos in vivo. Mórulas e blastocistos entre os dias 6 e 7 de desenvolvimento obtidos de ovelhas foram classificados quanto qualidade e estádio de desenvolvimento e uniformemente distribuídos entre os grupos experimentais. No ensaio 1 foram formados os grupos C1 (vitrificação sem suplementação) e LC1 (vitrificação suplementada com 3,72 mM L-carnitina). No ensaio 2, foram formados C2 (reaquecimento sem suplementação) e LC2 (reaquecimento suplementado com 3,72 mM L-carnitina). Após reaquecimento, os embriões foram cultivados in vitro para avaliação de sobrevivência às 24, 48 e 72h pós-reaquecimento. No ensaio 1, às 24h de CIV foram retirados 15 embriões reexpandidos (8 de C1 e 7 de LC1) e congelados em -80°C para extração de RNA e análise de expressão de genes relacionados ao metabolismo mitocondrial e estresse oxidativo através de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) e 22 embriões (9 de C1 e 13 de LC1) foram destinados para análise do número de células totais e de níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) através das colorações de Hoechst 33342 e CellROX® Green, respectivamente; às 72h de CIV, os embriões reexpandidos foram fixados para posterior análise de índice apoptótico por imunofluorescência com caspase-3. No ensaio 2 foram realizadas as mesmas avaliações de sobrevivência, sendo retirados 18 embriões (6 de C2 e 12 de LC2) do cultivo às 24h para congelação e análise de expressão dos mesmos genes avaliados no ensaio 1. Não foi observada diferença (p> 0,05) nas taxas de sobrevivência entre C1 e LC1 e entre C2 e LC2, tampouco nos níveis de ROS, número total de células, número de células apoptóticas e índice apoptótico entre C1 e LC1. Não houve diferença (p> 0,05) na expressão de CPT1 e CPT2 (carnitine palmytoil transferase 1 e 2) entre embriões frescos (CF), C1 e LC1 e entre CF e C2 e LC2, porém no ensaio 1 a abundância relativa de CrAT (carnitinte acetyl-O-transferase) foi sub-regulada (p< 0,05) em C1 vs CF. No ensaio 2, a abundância relativa de CrAT e PRDX1 foram sobre-reguladas (p< 0,05) em C2 vs CF, e a de CrAT foi sub-regulada (p< 0,05) em LC2 vs CF. Conclui-se que na dosagem de 3,72 mM, a LC empregada durante a vitrificação ou reaquecimento, apesar de não ser observada diferença nas taxas de sobrevivência e na qualidade de embriões ovinos da raça Santa Inês produzidos in vivo, estimulam a resposta antioxidante celular e beneficia as vias de homeostase energética celular em nível molecular. Abstract: Vitrification represents an important tool in genetic improvement programs of the herds since it allows the cryopreservation of gametes and embryos with a lower percentage of cryoinjuries. However, damage caused in the organelles during cryopreservation compromise embryo survival rate after warming. In this context, the present study aimed to evaluate two strategies of supplementation with L-carnitine (modulator of mitochondrial activity) in vitrification medium used for in vivo-produced Santa Inês sheep embryos. Morulae and blastocysts between days 6 and 7 of development obtained from ewes were classified by quality and developmental stage and distributed among the experimental groups. In essay 1 the groups C1 (vitrification without supplementation) and LC1 (vitrification plus 3.72 mM L-carnitine) were set-up. In essay 2, were set-up C2 (warming without supplementation) and LC2 (warming plus 3.72 mM L-carnitine). After warming, embryos were in vitro cultured for survival evaluation at 24, 48 and 72h post-warming. In essay 1, 15 reexpanded embryos (8 from C1 and 7 from LC1) were frozen at -80°C at 24h IVC for RNA extraction and expression of genes correlated to mitochondrial metabolism and oxidative stress through Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR); 22 embryos (9 from C1 and 13 from LC1) were analysed for total cell number and reactive oxygen species (ROS) levels through Hoechst 33342 and CellROX® Green staining techniques, respectively; at 72h IVC, remaining reexpanded embryos were fixed for posterior analysis of apoptotic index by caspase-3 immunofluorescence staining. In essay 2 the same survival evaluations were performed. Eighteen embryos (6 from C2 and 12 from LC2) were withdrawn at 24h IVC for freezing and gene expression analysis of the same genes evaluated in essay 1. No difference was observed (p> 0.05) in survival rates between C1 and LC1 and between C2 and LC2, nor in ROS levels, total cell number, apoptotic cell number and apoptotic index between C1 and LC1. There was no difference (p> 0.05) in the expression of CPT1 and CPT2 (carnitine palmytoil transferase 1 and 2) between fresh embryos (CF), C1 and LC1 and between CF and C2 and LC2, but in essay 1 the relative abundance of CrAT (carnitine-O-acetyltransferase) was downregulated (p< 0.05) in LC1 (vs. CF), and the relative abundance of PRDX1 (peroxiredoxin 1) mRNA was downregulated (p< 0.05) in C1 vs CF. In essay 2, the relative abundance of CrAT and PRDX1 were upregulated (p< 0.05) in C2 vs CF, and CrAT was downregulated (p< 0.05) in LC2 vs CF. In conclusion, 3.72 mM LC during vitrification or warming, , it stimulate the cell antioxidant response and benefits cellular energy and homeostasis pathways at a molecular level, although no differences in survival rates and quality of in vivo produced Santa Inês sheep embryos are observed

portugais. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) - Universidade Federal Fluminense, Niterói. Orientação: Felipe Zandonadi Brandão; Coorientação: Jeferson Ferreira da Fonseca (CNPC), Ribrio Ivan Tavares Pereira Batista.