Métagénomique de la microflore du bois de la vigne.

Plus de 10% du vignoble français est actuellement improductif pour cause de maladies affectant le bois des ceps. L’ESCA, la principale de ces maladies, est en continuelle progression dans le vignoble français et mondial. Cette maladie est préoccupante car il n’existe aucun traitement efficace depuis l’interdiction de l’arsénite de sodium en 2001. L’ESCA serait provoquée par un complexe de micro-organismes (essentiellement des champignons des genres Phaeomoniella, Chlamydospora, Phaeoacremonium et Botryosphaeria) dont les rôles respectifs restent mal connus. La caractérisation de la microflore colonisant les tissus ligneux des ceps de vigne a été entreprise par une approche de métagénomique consistant en un séquençage haut débit (pyroséquençage 454 Roche) de régions génomiques d’intérêt taxonomique (ITS et ADNr 18S fongique, ADNr 16S bactérien) amplifiés à partir d’ADN extraits de bois de vigne à l’aide d’amorces spécifiques de chaque type d’organisme. Un témoin de pyroséquençage a été constitué avec un mélange d’ADN de champignons connus. Un ensemble de 8 échantillons indépendants issus de zones différentes sur des ceps symptomatiques et asymptomatiques ont été utilisés pour amplifier ces régions génomiques par PCR en vue de leur séquençage. Ainsi, 35 produits de PCR étiquetés par leurs amorces sont mélangés pour la construction des banques de pyroséquençage. Parallèlement à ces expériences, le clonage/séquençage de certains produits de PCR a permis de montrer la spécificité des amorces 18S et ITS choisies. Cependant des problèmes de spécificité des primers de l'ADNr 16S ont été rencontrés et de nouvelles amorces seront utilisées pour le second run. Les expériences de pyroséquençage ont été réalisées sur la plateforme Genotoul de Toulouse. Le nombre de séquences obtenues par échantillon varie de 100 à 100 000 séquences brutes pour un total de 1335000 séquences pour le run. Les analyses bioinformatiques ont été d’abord réalisées sur l’échantillon correspondant à un mélange d’ADN fongiques connus, à l’aide d’un pipeline reposant sur les logiciels QIIME et MEGAN. Cette analyse montre qu’il existe un nombre significatif de variations nucléotidiques provenant de la PCR et du séquençage 454, mais qu’il est néanmoins possible de regrouper les séquences par espèce par ces deux méthodes. Cette analyse montre l’intérêt et les limites du pyroséquencage de produits de PCR de régions génomiques.