A study of freezing tolerance in red clover (Trifolium pratense L.)

The ability to tolerate freezing temperatures is one of the traits that allows successful overwintering of red clover (Trifolium pratense L.) at Nordic latitudes. Freezing tolerance (FT) is enhanced during a period of cold acclimation (CA) at low above freezing temperatures, which induces major changes at the transcriptional, proteomic and metabolic level in perennial plants. However, little is known about biochemical changes induced by CA and how these are related to the level of FT in Nordic red clover. Furthermore, even if persistency has been one of the main breeding goals in red clover in the Nordic countries since systematic breeding started, there is a lack of knowledge on the morpho-physiological traits associated with improved FT as well as its genetic control in red clover. Genetic resources conserved in gene banks may be an important source for the improvement of FT and thereby winter survival of red clover. However, there are very few recent studies which characterized gene bank material of Nordic origin for traits related to winter survival and no studies specifically characterized FT in this species. A better understanding of FT from the biochemical and genetic point of view, as well as the characterization of available genetic resources for FT and other morpho-physiological traits related to it is of primary importance for further improvement of this trait through selection and breeding. Overall, the aim of this PhD project was to conduct a comprehensive study of freezing tolerance in red clover, with three main sub-goals. The first was to assess the phenotypic variation for FT among gene bank accessions of Nordic origin, also considering its association with other morpho-physiological traits (research component 1). The second was to investigate the major biochemical changes induced by CA and if and how these differ between accessions with different levels of FT (research component 2). Lastly, we wanted to detect genomic regions involved in the control of FT in red clover, possibly identifying candidate genes for the trait (research component 3). To achieve these goals, we characterized 48 red clover accessions of Nordic origin for several phenotypic traits in a multi-location multi-year field trial and in a controlled condition experiment and compared them with commercial cultivars. We found that traits related to plant size were strongly associated with late flowering and upright growth and differed between landraces/cultivars on the one hand and wild populations on the other. There was a large genotype by environment interaction on winter survival, which only partially correlated with FT under controlled conditions. Several gene bank accessions had better winter survival than commercial cultivars and large variation for FT was also identified among the former, suggesting that these accessions are a precious genetic resource for future improvement of these traits. The climate at the collection site of gene bank accessions was also significantly associated with phenotypic variation. This suggests that the integration of climatic information in analyses for the characterization of gene bank material can be useful to facilitate the collection, conservation, and utilization of red clover genetic resources in the Nordic region. We then selected the five accessions with the highest (freezing tolerant group, FT) and the five with the lowest (freezing susceptible group, FS) freezing tolerance. These accessions were characterized for their contents of carbohydrates, amino acids, and phenolic compounds in the plant crowns after a short-term cold acclimation (CA) treatment. The major effects of CA were the depletion of starch reserves and the accumulation of water-soluble sugars and free amino acids. Specific phenolic compounds were also affected in their content by CA. The contents of various carbohydrates (raffinose, pinitol), amino acids (arginine, serine, alanine, valine, phenylalanine) and one phenolic compound (a pinocembrin isomer-G derivative) were more elevated in FT than FS accessions, suggesting that these compounds have a role in the freezing tolerance of red clover. Finally, 393 red clover accessions of diverse origin were genotyped using genotyping by sequencing (GBS) on pools of individuals, and phenotyped for FT in a controlled conditions experiment. Genome wide association analyses (GWAS) for FT were conducted using both single nucleotide polymorphisms (SNPs) and within GBS loci haplotypes (HTPs) allele frequency data. The analyses detected various genomic regions significantly associated with FT. Ten independent SNP and HTP markers were found within or at a short distance from genes possibly involved in mechanisms associated with FT. The results of this study may be used for the development of molecular markers useful for the improvement of FT in red clover. Overall, the findings of this PhD project significantly enhanced the knowledge of FT in red clover. We described the phenotypic variation available for this trait and how it is associated with other phenotypic traits. We have now a better understanding of CA at the biochemical level and how this is associated with the level of FT in Nordic red clover. Furthermore, the identification of genomic regions significantly associated with FT is an important step forward for the dissection of the genetic base of this trait and is a starting point for further studies aiming at the development of genomic tools for the improvement of FT in red clover through breeding.

Evnen til å tåle kuldegrader er en av egenskapene som muliggjør vellykket overvintring av rødkløver (Trifolium pratense L.) ved nordiske breddegrader. Frosttoleranse (FT) øker i en periode med kulde-akklimatisering (CA) ved lave temperaturer over frysepunktet, noe som induserer store endringer på transkripsjonelt, proteomisk og metabolsk nivå i flerårige planter. Men lite er kjent om biokjemiske endringer som er indusert av CA og hvordan disse er relatert til nivået av FT i nordisk rødkløver. Og selv om varighet har vært et av hovedmålene i rødkløver-foredling i Norden siden systematisk planteforedling startet, er det mangel på kunnskap om de morfologiske og fysiologiske egenskapene knyttet til forbedret FT, samt genetisk kontroll av FT, i rødkløver. Genetiske ressurser bevart i genbanker kan være en viktig kilde til forbedring av FT og dermed vinteroverlevelse hos rødkløver. Det er imidlertid svært få nyere studier som har karakterisert genbankmateriale av nordisk opprinnelse med tanke på egenskaper relatert til vinteroverlevelse, og ingen studier som spesifikt har karakterisert FT i denne arten. En bedre forståelse av FT fra et biokjemisk og genetisk synspunkt, samt karakterisering av FT og tilknyttede morfologiske og fysiologiske egenskaper i tilgjengelige genetiske ressurser er av grunnleggende betydning for videre forbedring av denne egenskapen gjennom planteforedling. Det overordnede målet for dette ph.d.-prosjektet var å gjennomføre en omfattende studie av frysetoleranse i rødkløver, med tre delmål. Det første var å evaluere den fenotypiske variasjonen i FT blant genbank-aksesjoner av nordisk opprinnelse, og også ta i betraktning assosiasjoner med andre morfologiske og fysiologiske egenskaper (forskningskomponent 1). Det andre var å undersøke de viktigste biokjemiske endringene indusert av CA og hvordan disse varierer mellom aksesjoner med ulike nivåer av FT (forskningskomponent 2). Til slutt ønsket vi å finne genomiske regioner som er involvert i kontrollen av FT i rødkløver og om mulig identifisere kandidatgener for egenskapen (forskningskomponent 3). For å oppnå disse målene karakteriserte vi 48 rødkløver-aksesjoner av nordisk opprinnelse for flere fenotypiske egenskaper i et flerårig feltforsøk på flere steder og i et forsøk under kontrollerte betingelser, og sammenlignet dem med kommersielle sorter. Vi fant at egenskaper knyttet til plantestørrelse var sterkt assosiert med sen blomstring og oppreist vekst og var ulike i landsorter/sorter på den ene siden og ville populasjoner på den andre siden. Det var en stor genotype-miljøinteraksjon på vinteroverlevelse, og vinteroverlevelse var bare delvis korrelert med FT under kontrollerte forhold. Flere genbank-aksesjoner hadde bedre vinteroverlevelse enn kommersielle sorter, og stor variasjon for FT ble også identifisert blant de første noe som antyder at disse aksesjonene er en verdifull genetisk ressurs for fremtidig forbedring av disse egenskapene Klimaet på innsamlingsstedet for genbanktilgang var også signifikant assosiert med fenotypisk variasjon. Dette tyder på at integrering av klimatisk informasjon i analyser for karakterisering av genbankmateriale kan være nyttig for å lette innsamling, bevaring og utnyttelse av rødkløverens genetiske ressurser i Norden. Vi valgte deretter de fem aksesjonene med høyest og de fem med lavest frosttoleranse (hhv. frosttolerant gruppe, FT, og frost-sensitiv gruppe, FS). Disse aksesjonene ble karakterisert for innholdet av karbohydrater, aminosyrer og fenolforbindelser i stengelbasis etter en kortvarig kulde-akklimatisering (CA). De viktigste effektene av CA var reduksjon i stivelsesreserver og akkumulering av vannløselige sukkerarter og frie aminosyrer. Innholdet av spesifikke fenolforbindelser ble også påvirket av CA. Innholdet av forskjellige karbohydrater (raffinose, pinitol), aminosyrer (arginin, serin, alanin, valin, fenylalanin) og en fenolforbindelse (et pinocembrin-G-derivat) var mer forhøyet i FT enn FS-aksesjoner, noe som tyder på at disse forbindelsene har en rolle i frysetoleransen til rødkløver. Til slutt ble 393 rødkløver-aksesjoner av forskjellig opprinnelse genotypet ved hjelp av «genotyping by sequencing» (GBS) på aksesjons-nivå, ved å slå sammen bladprøver fra mange individer per aksesjon før DNA-ekstraksjon. Aksesjonenes FT ble også målt i et kontrollert eksperiment. Genomiske assosiasjonsanalyser (GWAS) for FT ble utført ved bruk av allelfrekvensdata for både polymorfismer i enkeltnukleotider (SNPs) og for polymorfe haplotyper innen GBS loci (HTPs). Analysene detekterte ulike genomiske regioner som er signifikant assosiert med FT. Ti uavhengige SNP- og HTP-markører ble funnet i eller i nærheten av gener som muligens er involvert i mekanismer assosiert med plantens evne til å tolerere lave frysetemperaturer. Resultatene av denne studien har implikasjoner for utviklingen av molekylære markører som er nyttige for forbedring av FT i rødkløver. Samlet sett har funnene fra denne studien forbedret kunnskapen om FT i rødkløver betydelig. Vi har beskrevet den fenotypiske variasjonen som er tilgjengelig for denne egenskapen og hvordan dette er assosiert med andre fenotypiske egenskaper. Vi har nå en bedre forståelse av CA på biokjemisk nivå og hvordan dette henger sammen med nivået av FT i nordisk rødkløver. Videre er identifiseringen av genomiske regioner som er signifikant assosiert med FT et viktig skritt fremover for disseksjon av det genetiske grunnlaget til denne egenskapen og er et utgangspunkt for videre studier som tar sikte på utvikling av genomiske verktøy for forbedring av FT i rødkløver gjennom planteforedling.