Developing new redox biosensors for sulfur compounds | Développement de nouveaux biosenseurs redox pour composés soufrés

Thèse confidentielle jusqu'au 5 décembre 2024. Puis, l'auteur a souhaité limiter l'accès aux membres de l'Enseignement supérieur français.

anglais. Over the last decade, the development of fluorescent redox biosensors has provided tools to study the in vivo dynamics of molecules such as the reduced and oxidized forms of glutathione or hydrogen peroxide. Cysteine being a key metabolite of sulfur metabolism, this PhD project aimed at developing a fluorescent redox biosensor specific for cysteine by coupling an oxidoreductase to roGFP2 (reduction-oxidation green fluorescent protein). First, the activities of several isoforms of cysteine desulfurases (CD) and rhodanese-domain containing proteins (Rhd), catalyzing cysteine desulfuration and trans-persufidation reactions, respectively, were analyzed in vitro in order to determine whether they could constitute good candidates for this oxidoreductase activity. These analyses revealed that a natural chimeric protein possessing both CD and Rhd domains efficiently oxidizes roGFP2, by catalyzing trans-persulfidation reactions from cysteine to roGFP2. This candidate protein was then fused to roGFP2 to generate the CD-Rhd-roGFP2 biosensor. In vitro, this protein is sensitive to oxidation in the presence of physiological concentrations of cysteine whereas oxidation by thiosulfate, another potential substrate of the Rhd domain, is negligible. In addition, the trans-persulfidation reactions between the protein domains leading to the oxidation of roGFP2 are not inhibited by physiological reducing systems. Nevertheless, the glutathione/glutaredoxin system specifically reduces roGFP2. The expression of this biosensor in the bacterium Escherichia coli revealed a dynamic response of the biosensor to exogenous addition of cysteine or cystine, paving the way for similar studies in organelles from other eukaryotic model organisms.

français. Au cours des dix dernières années, le développement de biosenseurs redox fluorescents a permis de générer des outils permettant d'étudier les dynamiques in vivo de molécules comme les formes réduite et oxydée du glutathion ou le peroxyde d'hydrogène. La cystéine étant un métabolite clé du métabolisme du soufre, l'objectif de ce projet de thèse était de développer un biosenseur redox fluorescent spécifique de la cystéine en couplant une oxydoréductase à la roGFP2 (reduction-oxidation green fluorescent protein). Tout d'abord les activités de plusieurs isoformes de cystéine désulfurases (CD) et des protéines à domaine rhodanese (Rhd), catalysant respectivement la désulfuration de la cystéine et des réactions de trans-persulfuration ont été analysées in vitro afin de déterminer si elles pouvaient constituer de bons candidats pour cette activité oxydoréductase. Ces analyses ont mis en évidence qu'une protéine chimérique naturelle bactérienne possédant des domaines CD et Rhd oxyde efficacement la roGFP2, au travers de réactions de trans-persulfuration depuis la cystéine vers la roGFP2. Cette protéine candidate a ensuite été fusionnée à la roGFP2 pour générer le biosenseur CD-Rhd-roGFP2. In vitro, cette protéine est sensible à l'oxydation en présence de concentrations physiologiques en cystéine alors que l'oxydation par le thiosulfate, autre substrat potentiel du domaine Rhd, est négligeable. D'une part, les réactions de trans-persulfuration entre les domaines protéiques menant à l'oxydation de la roGFP2 ne sont pas ou très peu inhibées par les systèmes réducteurs physiologiques. Néanmoins, le système glutathion-glutarédoxine réduit spécifiquement la roGFP2. L'expression de ce biosenseur chez la bactérie Escherichia coli, a révélé une réponse dynamique en réponse à des ajouts exogènes de cystéine ou de cystine ouvrant la voie à des études similaires dans les organites d'autres organismes modèles eucaryotes.