Protein promiscuity: key factor for the (re-)assimilation and the valorisation of the non natural platform molecule 2,4-dihydroxybutyrate in Escherichia coli | La promiscuité de protéines : facteur clef pour la (ré-)assimilation et la valorisation de la molécule plateforme non naturelle 2,4-dihydroxybutyrate chez Escherichia coli

anglais. Platform molecules are small molecules that act as an intermediate in the production of commodity products, between a carbon source (fossil or renewable) and these products. The production of these molecules in biotechnology is becoming increasingly significant as there is a wish to develop circular bioeconomy, utilising renewable carbon sources and generating environmentally friendlier molecules, especially within the field of plastics. 2,4-dihydroxybutyrate (DHB) is an example of this type of original platform molecule, because on one hand, it is not naturally produced by microorganisms, and on the other, it can be used to produce molecules for the fine chemicals and commodity sectors (1,3-propanediol and hydroxypropionic acid, and precursors for new biopolymers), pharmaceuticals (2-butyrolactone, butanetriol) and animal nutrition (methionine derivative). However, its production needs to be industrially attractive, which has been the subject of several projects carried out prior to my thesis and still ongoing today.DHB is not a naturally occurring molecule in its production host organism, Escherichia coli. This means that, aside from a few instances where a few substrate promiscuities were used for DHB production or enhancing strains that produce DHB, there is no detailed information available about how DHB interacts with the physiology of E. coli. My thesis work therefore contributed to the annotation of the metabolic pathways enabling DHB assimilation. By adding a racemic of DHB to the medium, it was found that DHB can be oxidised by three E. coli lactate oxidases, and produce 2-oxo-4-hydroxybutyrate (OHB), which turns out to be the precursor of DHB in some of the pathways designed for its biosynthesis. OHB can then be cleaved into formaldehyde and pyruvate by a number of specific pyruvate aldolases, dissimilated into formate and pyruvate respectively, which is then redirected to the cells' central carbon metabolism. This work also enabled identification of potential DHB importers.In parallel, the construction of a DHB biosensor was carried out, and its use in various applications was demonstrated. Finally, the possibility of using DHB as a monomer for the biosynthesis of innovative polymers was also investigated in this work. Before addressing this aspect, the requirement for the enzyme catalysing polymerisation to use the (D)-enantiomer of the substrate made it necessary to identify an enzyme capable to specifically reduce OHB to D-DHB.While other DHB uptake pathways have yet to be identified, and polymer synthesis still requires additional research, all these findings support the significance of substrate promiscuity in E. coli proteins (enzymes, transcription factor, transporter). Enzyme promiscuity simplifies the creation of new synthetic pathways for molecule production. However, the production of molecules, especially unnatural ones, demands special attention to prevent unwanted interactions that could be harmful or toxic to the cells. These interactions could severely hinder the production within the resulting constructed cellular factory.

français. Les molécules plateformes sont des petites molécules faisant l'interface, dans la production de produits de commodité, entre une source de carbone (fossile ou renouvelable) et ces produits. La production de ces molécules en biotechnologie a tendance à devenir une part importante des molécules plateformes en raison de la volonté de développer la bioéconomie circulaire, en utilisant des sources de carbone renouvelable, et en produisant des molécules moins compromettantes pour l'environnement, particulièrement dans le domaine des plastiques. Le 2,4-dihydroxybutyrate (DHB) est un exemple de ce type de molécule plateforme originale, car d’une part, cette molécule n’est pas produite naturellement par les micro-organismes, et d’autre part, elle peut permettre la confection de molécules dans les secteurs de la chimie fine et de commodité (1,3-propanediol et acide hydroxypropionique, et précurseurs pour de nouveaux biopolymères), de la pharmacie (2-butyrolactone, butanetriol) et de la nutrition animale (dérivé de la méthionine). Cependant, sa production doit être industriellement attractive, ce qui a été l’objet de nombreux travaux qui ont été réalisés antérieurement à ma thèse et qui sont encore en cours actuellement.Étant donné que le DHB est une molécule non naturelle pour son hôte de production Escherichia coli, ce qui signifie qu'à part quelques promiscuités de substrat ayant été envisagées pour la production du DHB ou l'amélioration de souches productrices, il n'existe pas de description de l'interaction du DHB avec la physiologie d'E. coli. Mon travail de thèse a donc contribué à l'annotation des voies métaboliques permettant l'assimilation du DHB. Par l'ajout d'un racémique de DHB dans le milieu, il a été constaté que le DHB peut être oxydé par trois lactates oxydases d'E. coli, et produire le 2-oxo-4-hydroxybutyrate (OHB), qui s'avère être le précurseur de DHB dans certaines voies conçues pour sa biosynthèse. L'OHB peut ensuite être clivé en formaldéhyde et en pyruvate par plusieurs aldolases pyruvate spécifiques, respectivement dissimilé en formate et pyruvate, lequel se voit redirigé vers le métabolisme carboné central des cellules. Ce projet a également permis de mettre en évidence de potentiels importeurs de DHB.En parallèle, la construction d'un biosenseur d'OHB a été effectuée, et son utilisation dans diverses applications démontrées. Enfin, la possibilité d'utiliser le DHB comme monomère pour la biosynthèse d'un polymère innovant a également été étudiée dans ce travail. Préliminairement à cet aspect, la contrainte pour l'enzyme catalysant la polymérisation d’utiliser l’énantiomère (D) du substrat a nécessité l'identification d'une enzyme catalysant la réduction de l'OHB vers le D-DHB. Bien que d'autres voies d'assimilation du DHB restent encore à être déterminées, et que la synthèse de polymère nécessite encore du travail, tous ces résultats soutiennent le fait que la promiscuité de substrat des protéines (enzymes, facteur de transcription, transporteur) d'E. coli est importante. Elle permet la facilitation de la mise en place de nouvelles voies synthétique de production de molécules. Mais dans le même temps, la production de molécules, et a fortiori non naturelles, requiert une attention particulière pour éviter des interactions indésirables, possiblement délétères ou toxiques pour les cellules, pouvant pénaliser significativement sa « production » par l’usine cellulaire ainsi construite.