Molecular determinants involved in the intracellular persistence phase of the pathogenic bacterium Listeria monocytogenes | Déterminants moléculaires impliqués dans la phase de persistance intracellulaire de la bactérie pathogène Listeria monocytogenes

anglais. Listeria monocytogenes (Lm) is an intracellular pathogenic bacterium responsible for a severe foodborne disease, listeriosis. While the mechanisms associated with invasive listeriosis have been extensively explored, those involved in asymptomatic carriage in humans and animals are poorly understood and very little studied. Several mechanisms may contribute to this, including the ability of Lm to adopt a viable but not culturable (VBNC) state or to enter dormancy in intracellular persistence vacuoles. Upon prolonged infection in human epithelial cells (hepatocytes and trophoblasts), Lm shifts from a replicative state to a slow metabolic state within vacuoles with lysosomal properties, the LisCVs. The underlying mechanisms are not elucidated but correlate with the disappearance of the motility factor ActA on the surface of the bacteria. The objective of my thesis was to better understand the mechanisms associated with the formation of LisCVs via two axes: (i) the study of the variability of the intracellular persistence phenotype according to the genetic and ecological diversity of Lm and (ii) the study of the transcriptional reprogramming of bacteria during the transition from the early replicative phase to the late persistence phase within LisCVs. We characterized 106 strains belonging to the 2 major lineages of the species (22 clonal complexes, CC), in our model of long-term infection of JEG-3 placental cells, for their ability to perform the key steps of the infectious process (entry, cytosolic dissemination and persistence). We established that the formation of LisCVs was a general property of the species. Only 4 variants (V1 to V4) with altered dissemination or persistence phenotypes were identified. These variants belong to CCs prevalent in foods but rarely associated with clinical cases (CC9 and CC121). These CCs have the particularity of producing a truncated InlA that strongly reduces their invasion capacity. In addition to the mutation in inlA, V1 showed defects from the early phase related to a yet undescribed mutation in hly, leading to the synthesis of a truncated non-functional LLO. V2 showed a "hyper-persistent" phenotype with large vacuoles, linked to the loss of the gshF gene, co-activator of PrfA, transcriptional regulator of virulence genes. V3 and V4 showed comparable "hypo-persistent" phenotypes specific to the late stage, with smaller LisCVs, more actin-associated bacteria and more ActA detected on the bacterial cells surface. V3 and V4 are genetically close and share 6 mutations that could be responsible for the phenotype and the impaired genes might be important markers of persistence. In order to highlight the transcriptional reprogramming of bacteria during the transition to the intravacuolar persistence phase, we obtained the transcriptomes of extracellular bacteria in exponential growth phase, and intracellular bacteria in early (replicating in the cytosol) and late (persisting in LisCVs) phases. We observed a massive reprogramming of genes in the late phase, with overexpression of genes associated with acid stress and repression of some divisional and metabolic genes, consistent with the degradative conditions of LisCVs and a slower life of intravacuolar bacteria. We studied deletion mutants of genes specifically induced during the late phase and sought to develop a system for detecting vacuolar bacteria via "sensor" genes. All these results suggest active mechanisms of LisCVs formation by Lm that may contribute to the asymptomatic carriage and persistence of Lm in tissues and explain the sometimes- long incubation periods of the pathogen.

français. Listeria monocytogenes (Lm) est une bactérie pathogène intracellulaire responsable d'une grave maladie d'origine alimentaire, la listériose. Si les mécanismes associés à la listériose invasive ont fait l'objet de nombreux travaux, ceux impliqués dans le portage asymptomatique chez l'homme et les animaux sont peu compris et très peu étudiés. Plusieurs mécanismes pourraient y contribuer, notamment la capacité de Lm à adopter un état viable but not culturable (VBNC) ou à entrer en dormance dans des vacuoles de persistance intracellulaire. Lors d'une infection prolongée dans des cellules épithéliales humaines (hépatocytes et trophoblastes), Lm passe d'un état réplicatif à un état métabolique ralenti au sein de vacuoles aux propriétés lysosomales, les LisCV. Les mécanismes sous-jacents ne sont pas élucidés mais corrèlent avec la disparation du facteur de motilité ActA à la surface des bactéries. L'objectif de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes associés à la formation des LisCV via 2 axes: (i) L'étude de la variabilité du phénotype de persistance intracellulaire selon la diversité génétique et écologique de Lm et (ii) L'étude de la reprogrammation transcriptionnelle des bactéries lors de la transition entre la phase précoce réplicative et la phase tardive de persistance au sein des LisCV. Nous avons caractérisé 106 souches appartenant aux 2 lignées majeures de l'espèce (22 complexes clonaux, CC), dans notre modèle d'infection à long terme de cellules placentaires JEG-3, pour leur capacité à réaliser les étapes-clés du processus infectieux (entrée, dissémination cytosolique et persistance). Nous avons mis en évidence que la formation des LisCV était une propriété générale de l'espèce. Seuls 4 variants (V1 à V4), présentant des phénotypes de dissémination ou de persistance altérés, ont été identifiés. Ces variants appartiennent à des CCs prévalents dans les aliments mais rarement associés à des cas cliniques (CC9 et CC121), qui ont la particularité de produire une InlA- tronquée et dont la capacité d'invasion est fortement réduite. En plus de la mutation dans inlA, V1 présentait des défauts dès la phase précoce liés à une mutation encore non décrite dans hly, conduisant à la synthèse d'une LLO tronquée non fonctionnelle. .V2 présentait un phénotype "hyper-persistant" avec de larges vacuoles, lié à la perte du gène gshF, co-activateur de PrfA, régulateur transcriptionnel des gènes de virulence. V3 et V4 montraient des phénotypes "hypo-persistants" comparables et spécifiques à la phase tardive, avec des LisCV plus petites, des bactéries plus associées à l'actine et plus d'ActA détecté à la surface bactérienne. V3 et V4 sont génétiquement proches et partagent 6 mutations qui pourraient être responsables du phénotype et constituer des marqueurs importants de persistance. Afin de mettre en évidence la reprogrammation transcriptionnelle des bactéries lors de la transition vers la phase de persistance intravacuolaire, nous avons obtenu les transcriptomes des bactéries extracellulaires en phase exponentielle de croissance, des bactéries intracellulaires en phases précoce (réplicatives dans le cytosol) et tardive (en persistance dans les LisCVs). Nous avons observé une reprogrammation massive des gènes lors de la phase tardive, avec une surexpression des gènes associés au stress acide et une répression de certains gènes de division et du métabolisme, cohérent avec les conditions dégradatives des LisCV et une vie ralentie des bactéries intravacuolaires. Nous avons étudié des mutants de délétion de gènes spécifiquement induits lors de la phase tardive et cherché à mettre au point un système de détection des bactéries vacuolaires via des gènes « senseurs ». L'ensemble de ces résultats suggèrent des mécanismes actifs de formation des LisCV par Lm qui pourraient contribuer au portage asymptomatique et à la persistance de Lm dans les tissus et expliquer les périodes d'incubation parfois longues du pathogène.