Aislamiento y cuantificación de bacterias epífitas del filoplano de banano (Musa AAA cv. Grande Naine) y selección de cepas quitinolíticas y glucanolíticas como potenciales antagonistas de Mycosphaerella fijiensis, agente causal de la Sigatoka negra

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2013.

La Sigatoka negra es considerada la enfermedad más limitante del cultivo de banano, reduce el rendimiento y la productividad dentro de la plantación. Actualmente, su combate se realiza principalmente con la aplicación de fungicidas químicos sin embargo, el patógeno ha desarrollado resistencia a algunos de los primordiales fungicidas de acción sitio-específico, lo que ha conllevado progresivamente a aumentos en el número de aplicaciones y en el costo de combate de la enfermedad con el consiguiente mayor riesgo ambiental. Ante la tendencia por una demanda de banano con mayores exigencias de inocuidad, calidad, sanidad y nutrición, surge la necesidad de buscar un método alternativo y complementario de manejo como lo es el control biológico. Varios estudios han identificado el potencial de las bacterias del filoplano para el control biológico de la Sigatoka negra. Por lo tanto, esta investigación se llevó a cabo con el objetivo de evaluar la población de bacterias epífitas presentes en hojas de banano y aislar cepas con potencial antagonistas de M. fijiensis, agente causal de la Sigatoka negra. Las muestras se obtuvieron de una plantación experimental donde se realizan todas las prácticas agronómicas excepto la aplicación de fungicidas. En dicha plantación, se seleccionaron aleatoriamente diez plantas con seis hojas para la recolección de las muestras y de cada hoja se evaluaron dos secciones de la lámina foliar: el borde y el interior (paralelo a la vena central). Las bacterias totales fueron aisladas y cuantificadas en un medio pobre en nutrientes con fungicida mientras que las bacterias con potencial antagonista se aislaron en dos medios semiselectivos (con fungicida, pobre en nutrientes y rico en quitina y harina de cebada [como fuente de β(1-3) glucano], respectivamente). La densidad poblacional fue estimada mediante la técnica de dilución en medios de cultivo y las características físicas de cada bacteria fueron obtenidas mediante observación de cada colonia formada. Adicionalmente, mediante PCR tiempo real se cuantificó el ADN total de bacterias, Bacillus spp., Streptomyces spp. y hongos en las muestras. El número de bacterias totales y glucanolíticas presentaron una tendencia lineal en la cual aumentaron sostenidamente de la hoja 1 a la 6; asimismo, se cuantificó una mayor concentración de estas en el borde de la hoja que en la vena central de la misma. Por el contrario, la población de bacterias quitinolíticas fue similar en las seis hojas evaluadas y no se observaron diferencias en la cantidad presente entre el borde y la vena central. En total se aislaron 182 bacterias con potencial antagonista contra M. fijiensis de las cuales 70 (38,5 %) mostraron evidencias de actividad glucanolítica, 35 (19,2 %) presentaron actividad quitinolítica y 77 (42,3 %) revelaron actividad glucanolítica y quitinolítica. El análisis molecular reflejó una mayor biomasa de ADN bacterial total en el borde que en la vena central; sin diferencias en la biomasa de Bacillus y Streptomyces, así como de hongos. En cuanto a la edad de la hoja, todos los microorganismos evaluados presentaron un comportamiento similar, que se reflejó una mayor biomasa de ADN en las hojas viejas que en las hojas nuevas. Los resultados obtenidos en esta investigación confirman el potencial que pueden tener los microorganismos epífitos del filoplano de banano como potenciales agentes de control biológico de la Sigatoka negra.

Black Sigatoka is considered the most limiting disease of banana cultivation, reduces plantation yield and productivity. Currently, the control of the disease is focuses on the application of chemical fungicides however; the pathogen has developed resistance to them, increasing the number of applications and the cost of the disease control with a greater environmental risk. The increased demand for more safety, quality, health and nutritional bananas arises the requirement to find an alternative and complementary method like the biological control. Studies have identified the potential of the phylloplane bacteria for biological control against black Sigatoka. Therefore, this research was conducted with the aim of evaluate the epiphyte bacteria population present in the banana leaves and to isolate strains with potential antagonistic for M. fijiensis, causal agent of black Sigatoka. The samples were obtained from an experimental farm where are perform all agronomic practices except fungicide application. In such planting, were selected ten randomly plants with six leaves and from each leaf were analyzed two positions (edge and the central vein). Total bacteria were isolated and quantified in a nutrient poor medium with fungicide while potentially antagonistic bacteria were isolated in two semi-selective media (with fungicide, poor in nutrients and rich in chitin and barley flour [as a source of β(1 3) glucan]). The population density was estimated by dilution technique in culture media and the characteristics of each bacterium were obtained by observation the colony formed. Additionally, with real time PCR was quantified bacteria, Bacillus spp., Streptomyces spp. and fungi DNA in each sample. The total and glucanolytic bacteria showed a linear trend in which the population increase steadily from leaf 1 to 6; also, higher bacteria concentration were quantified on the outside of the leaf. By contrast, the chitinolytic bacteria population was similar in all six leaves tested and no present differences between the rim and the central vein. A total of 182 potential antagonistic bacteria against M. fijiensis were isolated from the banana phylloplane which 70 (38.5%) showed evidence of glucanolytic activity, 35 (19.2%) had chitinolytic activity and 77 (42.3%) revealed glucanolytic and chitinolytic activity. Molecular analysis showed a higher biomass of total bacterial DNA in the edge than in the central vein, with no differences in the biomass of Bacillus and Streptomyces and fungi. As for the age of the leaf, all microorganisms tested showed a similar pattern, reflected a higher biomass of DNA in old leaves than in young leaves. The results obtained in this study confirm that biological control agents of black Sigatoka can be isolated from the banana phylloplane.

Corporación Bananera Nacional S.A. (CORBANA)